細(xì)胞凍存步驟怎么做才更好？

細(xì)胞凍存簡(jiǎn)介

細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細(xì)胞置于 -196℃液氮中低溫保存，可以使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái),，這樣在需要的時(shí)候再?gòu)?fù)蘇細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn),。而且適度地保存一定量的細(xì)胞，可以防止因正在培養(yǎng)的細(xì)胞被污染或其他意外事件而使細(xì)胞丟種,，起到了細(xì)胞保種的作用,。

為什么要進(jìn)行細(xì)胞凍存

連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系容易發(fā)生遺傳漂變，有限細(xì)胞系終會(huì)發(fā)生衰老,，所有培養(yǎng)的細(xì)胞都易受到微生物污染,，即使運(yùn)轉(zhuǎn)情況的好的實(shí)驗(yàn)室也會(huì)遇到設(shè)備故障的問(wèn)題。由于已建立的細(xì)胞系是一種寶貴資源,，更換細(xì)胞系成本高昂,，而且耗費(fèi)時(shí)間，因此，十分有必要將細(xì)胞冷凍起來(lái)長(zhǎng)期保存,。除此之外,，還可以利用細(xì)胞凍存的形式來(lái)購(gòu)買、寄贈(zèng),、交換和運(yùn)送某些細(xì)胞,。

培養(yǎng)細(xì)胞凍存方案

以下實(shí)驗(yàn)方案介紹了培養(yǎng)細(xì)胞凍存的一般流程,。詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方案,，必須參閱針對(duì)具體細(xì)胞的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

用具紫外照射消毒（30min）：無(wú)菌培養(yǎng)瓶,，15ml 離心管,，移液管，移液槍,，槍頭,。采用通風(fēng)機(jī)通風(fēng) 3min。以 75% 酒精擦拭操作臺(tái)和雙手,，準(zhǔn)備好冰盒,，離心機(jī)調(diào)節(jié)至 800rpm，5min,。
配制細(xì)胞凍存液：凍存液應(yīng)該提前配置,，于 2℃至 8℃下儲(chǔ)存，直至使用,。凍存液常規(guī)通常配比為基礎(chǔ)培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1,。加大凍存液中血清量有利于某些脆弱的肝細(xì)胞或珍貴的細(xì)胞的保存，可調(diào)整為血清：DMSO=9:1,。

胰蛋白酶 /EDTA 消化

從培養(yǎng)箱中取出待傳代的細(xì)胞（將蓋子擰緊）,，75% 酒精進(jìn)行瓶口消毒，吸掉培養(yǎng)細(xì)胞的舊培養(yǎng)基,，PBS 緩沖液洗去殘留的舊培養(yǎng)基,，加入消化液，放入顯微鏡下觀察,，待所有細(xì)胞變圓后立即拿入超凈臺(tái)內(nèi),，加入細(xì)胞*培養(yǎng)基中止消化，消化時(shí)間為 1-5min,，具體以細(xì)胞而異,，采用無(wú)菌吸管輕輕吹打細(xì)胞表面，注意吹打全部培養(yǎng)表面,，取所有的細(xì)胞懸液放入干凈的 15ml 離心管內(nèi),，每分鐘 1000rpm，5min。

細(xì)胞凍存

取出凍存管,，注明細(xì)胞名稱,，代數(shù)，日期,。離心后,，以無(wú)菌吸管吸棄上清，不要吸到底部的細(xì)胞沉淀,。將細(xì)胞沉淀與凍存液充分混勻,，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，將細(xì)胞總數(shù)調(diào)節(jié)成細(xì)胞數(shù)量為 5-10*105/ml 為宜,。將細(xì)胞凍存懸液分裝進(jìn)細(xì)胞凍存管中,，一般 2ml 的凍存管中裝入 1-1.5ml 凍存液為宜。嚴(yán)密封口后,，使用可控制降溫速度的冷凍裝置冷凍細(xì)胞,，使溫度每分鐘大約降低 1℃?；蛘?，將裝有細(xì)胞的凍存管放入異丙的醇凍存盒中，然后將凍存盒置于 –80℃條件下過(guò)夜,。若無(wú)凍存盒及其他凍存裝置,，可以先將凍存管置于 4℃ 30min，再 -20℃凍存 1h 直至*冷凍,，再轉(zhuǎn)移至 -80℃冰箱過(guò)夜,。第二天將已經(jīng)冷凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到液氮容器中，置于液氮上方的氣相空間中儲(chǔ)存,。

注意事項(xiàng)

凍存細(xì)胞系以備將來(lái)之用時(shí),，必須遵守以下原則。我們建議您嚴(yán)格遵守您所用細(xì)胞系附帶的操作說(shuō)明,，以便獲得的佳結(jié)果,。
• 在細(xì)胞處于生長(zhǎng)期密度達(dá)到 70-90% 的情況下進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞的凍存，并且細(xì)胞傳代盡可能靠前,。確保凍存前活細(xì)胞百分比至少為 90%,。請(qǐng)注意的佳凍存條件取決于所用細(xì)胞系。
• 細(xì)胞應(yīng)緩慢冷凍,，可使用可控制降溫速度的低溫冰箱或者低溫冷凍容器,，使溫度每分鐘大約降低 1°C。
• 必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基,。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑,。冷凍保護(hù)劑可降低培養(yǎng)基的冰點(diǎn),，并可減緩冷卻速度，大大降低冰晶形成的危險(xiǎn) (冰晶可損傷細(xì)胞,，導(dǎo)致細(xì)胞死亡),。注：DMSO 可促進(jìn)有機(jī)分子進(jìn)入組織。操作含 DMSO 的試劑時(shí),，應(yīng)采用與此類物質(zhì)安全危害相適應(yīng)的設(shè)備和操作規(guī)范,，并應(yīng)按照當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)處置此類試劑。建議可使用廠商生產(chǎn)的無(wú)血清細(xì)胞凍存液,，使用方便,，復(fù)蘇率高。
• 注意冷凍保護(hù)劑 DMSO 的品質(zhì)：DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),，無(wú)菌且無(wú)色,，以 5-10ml 小體積分裝,，4℃避光保存,，勿作多次解凍。
• 將冷凍的細(xì)胞于–70℃以下溫度儲(chǔ)存,；溫度高于–50℃時(shí),，冷凍的細(xì)胞將開(kāi)始變質(zhì)。
• 必須使用無(wú)菌凍存管儲(chǔ)存冷凍的細(xì)胞,。裝有冷凍細(xì)胞的凍存管可浸于液氮或者在液氮上方的氣相空間內(nèi)保存,。生物危害性物質(zhì)必須儲(chǔ)存在液氮上方的氣相空間內(nèi)。將密封的凍存管置于氣相空間儲(chǔ)存可避免凍存管發(fā)生爆炸,。如果使用液氮進(jìn)行儲(chǔ)存,，必須注意玻璃和塑料凍存管有發(fā)生爆炸的危險(xiǎn)，應(yīng)佩戴面罩或護(hù)目鏡,。
• 所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無(wú)菌狀態(tài),。必須采用正確的無(wú)菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行,。
• 實(shí)行細(xì)胞慢凍的原則：緩慢凍存,，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶,；相反,，結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜,、細(xì)胞器的損傷和破裂,。而復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶,，即冰晶的重結(jié)晶,。

HAKATA無(wú)血清細(xì)胞凍存液，直凍-80°C，無(wú)需程序降溫