細胞培養(yǎng)需注意事項

細胞培養(yǎng)在生命科研的地位舉足輕重,。實驗君的很多成果可謂是成也細胞培養(yǎng),，敗也細胞培養(yǎng)。然而細胞虐我千百遍,，我待細胞如初戀,！科研人是不會這么被輕易打敗的。

公司主營業(yè)務：胎牛血清（HAKATA,、HyClone,、SERANA,、NTC、Corning,、BOVOGEN,、PAA、PAN,、SIGMA）,，無外泌體血清(SBI)，ELISA試劑盒,，細胞（400多種類通過STR鑒定），培養(yǎng)基（干粉,、液體）,，雙抗，胰酶,，CST,abcam,sigma等抗體,。詳詢。

新買或惠贈的細胞

1.新買的或惠贈的細胞如何處理,？

不管買的細胞,、惠贈的細胞，剛拿到手應趕緊做這幾件事：檢測瓶子是否破裂,；培養(yǎng)基是否漏出,，是否渾濁；是否有支原體污染,；迅速擴增凍存,。

2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？

不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應的細胞培養(yǎng)基,，若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細胞大都無法立即適應,，造成細胞無法存活,。

3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因？

常見原因可能有：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳,；血清使用錯誤或血清的品質不佳,；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍后,，加以洗滌細胞和離心,；懸浮細胞誤認為死細胞；培養(yǎng)溫度使用錯誤,；培養(yǎng)箱氣體濃度達不到要求,；細胞置于 –80 ℃ 太久,。

復蘇凍存的細胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落的原因,？

冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂,，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,，是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時,，均應立刻將冷凍管再一次扭緊。

5.冷凍管應如何解凍,？

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時,，必須注意安全，可佩戴防護眼鏡和手套預防冷凍管的爆裂,。取出冷凍管后,，須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結晶對細胞造成損害,。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形,。

6.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,，是否應馬上去除 DMSO？

現(xiàn)在大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去,，但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外,，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后,，可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題,。

細胞培養(yǎng)用液

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類,？

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例：

8.如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基？

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件,。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞,，很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長?？傊?，shou選 MEM 做粘附細胞培養(yǎng),，RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。

9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅,？

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑：中性時為紅色,，酸性時為黃色，堿性時為紫色,。研究表明,，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應,，培養(yǎng)細胞,，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基,。由于酚紅干擾檢測,，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基,。

10.細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應該注意什么？

細胞培養(yǎng)基配好后,，要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h,，已檢測培養(yǎng)液是否有污染，然后方可用于實驗,。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定,。一個批號試用效果良好后，就可一次購入較多同一批號的血清,，這樣實驗條件穩(wěn)定,，配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜,，一次配液不要太多,，一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充，二是量大易造成污染,。

11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,，顏色會偏紫色？

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,，培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出,，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性，而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 （通常為 phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色,。培養(yǎng)基偏堿的結果,， 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,，可以通入無菌過濾 CO2,，以調(diào)整 pH 值,。

12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基？

對于應用培養(yǎng)細胞進行分離制備細胞生長因子,、單克隆抗體等應該選擇無血清培養(yǎng)基,。

13.如何選擇正確的血清種類？

14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類,？

不能,。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響,。來自不同物種的血清,，在一些物質或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活,。

15.血清滅活是否必須,？

這個問題現(xiàn)在有爭議。有人主張價格不菲的血清中含有諸如生長因子,，維生素,，氨基酸等珍貴物質，而將它們置于50℃以上的溫度長達30分鐘的熱處理會對血清中的生長因子,，氨基酸等成分帶來的負面影響,。盡管如此，在大多數(shù)實驗室之中血清的熱滅活還是作為常規(guī)來執(zhí)行,，尤其是在昆蟲細胞和胚胎干細胞培養(yǎng)中,。

16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素？

除特殊篩選系統(tǒng)中外,，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,，培養(yǎng)基中不應添加任何抗生素。

17.何時更換培養(yǎng)基,？

視細胞生長密度而定,，或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可,。

細胞傳代

18.細胞傳代的方法都有哪些,？

根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代,；部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代,；懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代，或用自然沉降法吸除上清后,，再吹打,。

19.原代培養(yǎng)的傳代應注意的問題？

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前，不要急于傳代,；原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長,，不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理,，并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞,；

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷；傳代時細胞接種數(shù)量要多一些,，使細胞能盡快適應新環(huán)境而利于細胞生存和增值,；隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的,？應如何處理,？

EDTA作用較胰蛋白酶緩和，主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+,、Mg2+,，這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞*分散,，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用,，效果較好。常用比例為1：1或者2份EDTA：1份胰蛋白酶,。EDTA的工作液濃度為0.02%,，用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置,。如果使用EDTA,，在終止消化前,，需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液,。次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 –20 ℃,，避免反復冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低,，并可減少污染的機會。

21.欲將一般動物細胞離心下來,，其離心速率應為多少轉速,？

欲回收動物細胞，其離心速率一般為800~1000 rpm,，5~10 分鐘,，過高的轉速，將造成細胞死亡,。

22.細胞的接種密度為何,？

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一,。

23.細胞交叉污染的可能原因,？

多種細胞系進行維持傳代操作時,，各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染,。

細胞凍存

24.冷凍培養(yǎng)基為什么要加DMSO,？

因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接凍存時，細胞內(nèi)外的水分都會很快形成冰晶,，冰晶的形成將造成細胞損傷,，還可引起細胞的的死亡。目前多采用甘油和DMSO做保護劑,。這兩種細胞無明顯毒性,，分子量小，溶解度大,，易穿透細胞,，可以使冰點下降，提高包膜對水的通透性,。

25.DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何,？

冷凍保存使用的 DMSO 等級，必須為 Tissue culture grade 的 DMSO,，其本身即為無菌狀況,，次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于 4 ℃,，避免反復冷凍解凍造成 DMSO 的裂解而釋出有害物質,，并可減少污染的機會。若要過濾 DMSO,，則須使用耐 DMSO 的 Nylon 材質濾膜,。

26.欲冷凍保存時，細胞冷凍管內(nèi)應有多少細胞濃度,？

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,，融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

27.冷凍保存細胞的方法,？

冷凍保存方法一：冷凍管置于 4 ℃ 30~60 分鐘 →-20 ℃ 30 分鐘 → -80 ℃ 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽 vapor phase 長期儲存,。

冷凍保存方法二： 冷凍管置于已設定程序的可程序降溫機中每分鐘降 1~3 ℃ 至 –80 ℃ 以下， 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存,。–20 ℃ 不可超過 1 小時,，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入 –80 ℃ 冰箱中,，存活率稍微降低一些。

28.細胞凍存太多會不會浪費？

每一種細胞系都應有充足的凍存儲備,，防止由于細胞污染等因素造成的細胞系的絕種,，而且每一批次培養(yǎng)的細胞狀態(tài)都不同，應該挑選幾個狀態(tài)較好的批次凍存保種,。另外二倍體細胞等有限細胞系如果暫時不用凍存以免傳代太多,，造成細胞衰老或者發(fā)生改變。

29.如何識別和預防常見的細胞污染,？

細菌污染：細菌是一種原核細胞微生物,，其大小以微米(μm)計。常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和大腸桿菌,、假單胞菌等,，革蘭氏陰性菌中白色葡萄球菌等比較常見。

一旦發(fā)生細菌污染較易發(fā)現(xiàn),，多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃,，表明有大量酸性物質產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象,；有時靜置的培養(yǎng)液液體初看不混濁,，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂起,。倒置顯微鏡下觀察,，可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮。必要時可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實細菌種類,；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染,，可取出少量培養(yǎng)液用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可取10ml細胞懸液以100rpm離心5min,，沉淀中加入無抗生素的培養(yǎng)液2ml,，置于37℃培養(yǎng)，24h可得結果,。污染后細胞發(fā)生病理改變,，胞內(nèi)顆粒增多,、增粗,，后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失,。

看到這種,，別猶豫了你的細胞被污染了，那么怎么辦呢,，基本原則立馬扔掉,，別擴大污染，如果你的細胞真的十分寶貴，先用帶有雙抗的PBS反復沖洗幾遍,，然后再培養(yǎng)液中加入硫酸慶大霉素,、新霉素（50ug/ml）等，培養(yǎng)3天后換成帶有雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng),。

真菌污染：是細胞培養(yǎng)過程中常見的一種,，尤其在梅雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。污染培養(yǎng)細胞的多為煙曲霉,、黑曲霉,、毛霉菌、孢子霉,、白念珠菌,、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物,。一般肉眼可見,，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁,，倒置顯微鏡下可見于細胞之間縱橫交錯穿行的絲狀,、管狀、及樹枝狀菌絲,，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中,。很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,，散在細胞周邊和細胞之間生長,。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆,。真菌污染后，細胞生長變慢,，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡,。

真菌污染真的不建議處理，因為孢子容易飄散,，可能這瓶沒9過來,，又擴大了污染，建議預防為主,，在培養(yǎng)箱的水中加入硫酸銅,，就是藍色的那種東西。哎,，如果你非救不可,，可以采用兩性霉素B（0.25-2.5）,，三天后換液加入含PS的培養(yǎng)液。

支原體污染：支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨立生活的微生物,。約有1%可通過濾菌器,。支原體無細胞壁形態(tài)呈高度多形性?？蔀閳A形,、絲狀或梨形。

支原體形態(tài)多變,，在光境下不易看清內(nèi)部結構,。電鏡下觀察支原體膜為三層結構。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束,。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間,。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小,，且中央無顆粒群或中央束,。

支原體污染細胞后，培養(yǎng)液可不發(fā)生混濁,。多數(shù)情況下細胞病理變化輕微或不顯著,，細微變化也可由于傳代、換液而緩解,，因此易被忽視,。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢,，甚至從培養(yǎng)器皿脫落,。

如果懷疑細胞被支原體污染可使用支原體檢測試劑盒進行檢測，如果確定是支原體污染可以選擇支原體去除試劑進行處理,。