為什么我加了雙抗,，細(xì)胞還是污染了,？

HyClone α-MEM培養(yǎng)基 α-MEM SH30265.01

上海蒂科生物專注生物科研試劑：胎牛血清（HAKATA,、HyClone,、SERANA,、NTC,、Corning、BOVOGEN,、PAA,、SIGMA等），無外泌體血清(SBI),，ELISA試劑盒（HAKATA自主品牌,、進(jìn)口），2萬多株細(xì)胞（含400多種類通過STR鑒定）,，培養(yǎng)基（干粉,、液體）,，雙抗，胰酶,，sigma試劑等,，本公司供應(yīng)原裝胎牛血清，*的服務(wù),、真誠的態(tài)度,、堅持以質(zhì)取勝，做您的實驗專家,。;.

HyClone α-MEM培養(yǎng)基 α-MEM SH30265.01  

★CQ★現(xiàn)象描述:

我昨天早上傳的代,，晚上看還是好好的，培養(yǎng)基顏色正常,，今天早上9點鐘左右,，培養(yǎng)基就變渾濁了，顯微鏡下觀察細(xì)胞好多都已經(jīng)漂起來了,，明顯是污染了,，但我的培養(yǎng)液里明明加了雙抗了啊,？

這個問題等同于,，

明明有免疫系統(tǒng)的我們

為什么還是感冒了呢

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細(xì)菌對雙抗都有耐藥性,，所以加了也不一定就能殺死,；雙抗的保存方式的問題，青霉素在37℃下很快就會分解掉,；污染的細(xì)菌是不是在抗菌譜中,；如果是真菌的話雙抗就沒有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細(xì)胞要從源頭做起,，杜絕各種污染

剛買來的或借來的細(xì)胞株，一般都會在培養(yǎng)基中添加抗生素,，待通過污染測試后,，大量培養(yǎng)時則不要加抗生素；

還有就是無血清培養(yǎng)時建議zuihao不加雙抗,，因為沒有血清的保護(hù),，細(xì)胞此時是比較脆弱的，很容易受到雙抗的毒副作用影響,。

加雙抗并不是除菌的方法,。要防止污染除了使用雙抗，還要注意污染源大多來自換液和消化時的操作不正規(guī),，如果你在處理細(xì)胞得操作過程不規(guī)范,，即便加入雙抗也很難避免污染,。就像抵抗力再強的漢紙，如果任由自己在寒風(fēng)中,、雨雪天氣里任性,，像一顆海草隨風(fēng)飄搖的話，終有崩潰的一天,。所以保證細(xì)胞處理過程或培養(yǎng)基配制過程中的無菌操作才是關(guān)鍵,。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細(xì)胞污染都用相同的解決辦法

很多實驗室在遇到細(xì)胞污染，準(zhǔn)確的說是懷疑細(xì)胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)不好）時,，都會選擇一種處理方式——扔掉,！害怕他會傳染到其他的細(xì)胞，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”,，而沒找到“真兇”,。

并不是所有的細(xì)胞污染都能用扔掉解決，也并不是所有的細(xì)胞污染都可以用同一種試劑解決,。

辨別細(xì)胞狀態(tài),，找到根源，“對癥下藥”才是關(guān)鍵,。

（1）細(xì)菌污染 

狀態(tài)：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形,，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃,，對細(xì)胞生長影響明顯。 

解決方法： 

1.仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況,，是否在高壓滅菌時放氣時間和壓力足夠,！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染,，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象,！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑，以及的細(xì)菌清除劑,。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基,，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無變化，不渾濁,，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物,，顯微鏡下觀察，若感染真菌可看到分叉細(xì)絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同）,，若感染霉菌,，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu)，不透明，真菌及霉菌對影響細(xì)胞的生長影響不大,。 

解決方法： 

1.保證細(xì)胞房的干凈整潔,，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長)。 

2.控制外來人員進(jìn)出實驗室,。 

3.對實驗室及培養(yǎng)箱進(jìn)行*消毒,，推薦使用專門針對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑。 

4.若細(xì)胞非常珍貴,，且不易獲得,，可以對污染的細(xì)胞采取如下操作。 

懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞并離心,，用PBS漂洗,，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗細(xì)胞,，重復(fù)此操作數(shù)次,。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會渾濁,，國內(nèi)血清很多沒做支原體陰性檢測,，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去,。支原體感染細(xì)胞以后,，細(xì)胞病變不很明顯，只是生長緩慢,，直至慢慢凋亡,。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實驗室新購買的血清及培養(yǎng)基需檢測是否含有支原體，引進(jìn)的新品種細(xì)胞需做支原體檢測,，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑,。 

>>補救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋，加入細(xì)胞正常培養(yǎng),；并根據(jù)細(xì)胞污染的嚴(yán)重程度,，處理3～6次即可*清除細(xì)胞支原體污染問題。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜,，也可以通過空氣傳播,，低倍下為黑色點狀，高倍鏡下可看見黑色的小蟲游來游去,，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會太影響,，細(xì)胞還可以用,。常常可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑,，改變培養(yǎng)基的品牌,。血清凍融采取逐級凍融等方法。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀,，革蘭氏染色陽性,、陰性或可變，以周生鞭毛運動,。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染,，會在顯微鏡下看到一些桿狀游動的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有桿菌污染，棄掉培養(yǎng)基,，用PBS清洗3遍,；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑，即：邊加邊搖勻,；

c. 每天處理一次,，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天，即可*清除桿菌污染,。

除以上污染源外,，配液消毒問題、操作問題也是污染原因之一,。關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況,，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察,，如果沒有細(xì)菌生長就是操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問題,。 

★CQ★TIPs：細(xì)胞操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境問題如何解決？ 

1,、提高細(xì)胞操作技巧,，禁止交叉使用槍頭，在酒精燈火焰5公分距離內(nèi)操作,。 

2,、定期對細(xì)胞培養(yǎng)箱消毒，培養(yǎng)箱水盤中的水也要定期更換,，并使用無菌水,。 

3、進(jìn)入細(xì)胞房之前及在無菌操作臺操作細(xì)胞實驗之前需使用紫外燈照射30min,。定期使用細(xì)胞房除菌劑對細(xì)胞房空間進(jìn)行處理,。

4、每次開培養(yǎng)箱之前需用酒精消毒雙手,。 

5,、用培養(yǎng)箱除菌劑和水盤抑菌劑定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。 

6、配制的培養(yǎng)基需驗證無菌后方可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),。