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如何用好HILIC,，賽默飛幫您選擇色譜柱！
對(duì)于做液相色譜分析的人來(lái)說(shuō),，我們先接觸到的往往是對(duì)于弱極性或者中等極性化合物的分離,。對(duì)于這類(lèi)化合物的分析來(lái)說(shuō)，常用的是C8或者C18的反相色譜柱,，而且對(duì)于這類(lèi)化合物的方法開(kāi)發(fā)及條件優(yōu)化我們也都比較的熟悉,。但是近些年來(lái)越來(lái)越多的人開(kāi)始關(guān)注對(duì)極性化合物的分析，尤其是隨著對(duì)體內(nèi)代謝物的研究不斷發(fā)展,，對(duì)我們分析極性代謝物提出了更多的挑戰(zhàn),。
其實(shí)現(xiàn)在我們很多人也會(huì)采用反相色譜柱來(lái)分析一些極性化合物，比如流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑或者采用一些極性封端的反相柱,。當(dāng)然這些比較經(jīng)典的方法對(duì)于很多極性化合物的分析效果都是不錯(cuò)的,，但是都會(huì)面臨一些問(wèn)題。
比如,，加入離子對(duì)試劑,，本身離子對(duì)試劑對(duì)于色譜柱的壽命會(huì)有一定的影響，流動(dòng)相制備也相對(duì)復(fù)雜，另外很多時(shí)候也沒(méi)法與質(zhì)譜兼容,；采用極性封端類(lèi)的柱子,，流動(dòng)相中會(huì)用到比較高比例的水，壓力會(huì)比較高,，而且即使水相比例較高,，對(duì)于一些很強(qiáng)極性的物質(zhì)，仍然難以得到很好地保留,。而HILIC可以克服以上的缺點(diǎn),，大大滿(mǎn)足您對(duì)極性化合物的分析要求。
什么是HILIC ,？
HILIC是 Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography（親水作用液相色譜）的簡(jiǎn)稱(chēng),。我們首先要清楚，HILIC不是某個(gè)廠(chǎng)家的色譜柱系列或品牌,，也不是某個(gè)鍵合相,，它代表的是一種分離機(jī)理，而具備這種分離機(jī)理的鍵合相種類(lèi)非常多,。在HILIC中,，固定相是極性的，流動(dòng)相中的水相部分表現(xiàn)為強(qiáng)洗脫溶劑,，這與傳統(tǒng)的反相色譜法*相反,。
HILIC 發(fā)展歷史
HILIC分離模式早可以追溯到1951年，Gregor等人描述了一種離子交換樹(shù)脂表面的富水層概念,，在1975年的時(shí)候,，科學(xué)家在氨基柱上實(shí)現(xiàn)了糖類(lèi)的分析也是屬于HILIC的機(jī)理，但是直到1990年科學(xué)家Alpert才正式提出了HILIC的概念,但是這時(shí)候HILIC并沒(méi)有得到廣泛的推廣,，到了2000年以后,，越來(lái)越多的人開(kāi)始認(rèn)識(shí)并使用HILIC機(jī)理進(jìn)行極性化合物的分析，HILIC才得到了廣泛的認(rèn)可,。
HILIC 的作用機(jī)理
HILIC可以被認(rèn)為是反相液相色譜通過(guò)采用極性固定相來(lái)運(yùn)行的,。HILIC中采用的流動(dòng)相是含有少量水/緩沖鹽或其他極性溶劑的高比例有機(jī)相（>60%，常用乙腈）,。流動(dòng)相中的水形成一個(gè)富水層被吸附在固定相表面,，極性物質(zhì)首先進(jìn)入富水層得到保留。極性化合物是通過(guò)一個(gè)復(fù)雜的混合模式被保留的,，包括：富水層和流動(dòng)相之間的親水分配,、極性官能團(tuán)和固定相間的氫鍵作用以及離子官能團(tuán)的靜電作用。當(dāng)然,，親水分配是主要的保留模式,。從保留機(jī)理來(lái)看,，HILIC和反相色譜柱是有著非常大的差別的。
HILIC 流動(dòng)相
HILIC常用的流動(dòng)相是乙腈/水系統(tǒng),。比例：有機(jī)溶劑>60%，流動(dòng)相中至少需要3%的水相（因?yàn)镠ILIC保留機(jī)理是通過(guò)形成富水層來(lái)實(shí)現(xiàn)的）,。洗脫強(qiáng)度：四氫呋喃<丙酮<乙腈<異丙醇<乙醇 <甲醇<水,。對(duì)于條件摸索來(lái)說(shuō)，等度條件下建議80%乙腈為起始條件來(lái)調(diào)整比例,；梯度條件建議95%乙腈------60%乙腈,。對(duì)于HILIC來(lái)說(shuō)，我們有時(shí)也會(huì)在流動(dòng)相中加入緩沖鹽,，建議使用甲酸銨/乙酸銨（常用乙酸銨）緩沖液,，可以同時(shí)滿(mǎn)足溶解度（醋酸鹽在高比例乙腈中溶解度較好）以及質(zhì)譜檢測(cè)器兼容性的要求。
HILIC 固定相
上面我們提到,，HILIC保留機(jī)理的固定相種類(lèi)非常多,。常用的包括：
1，裸硅膠（如賽默飛的Hypersil Silica, SyncronisSilica及Accucore HILIC等）,，這種固定相在HILIC中也是應(yīng)用廣泛的固定相,，未鍵合硅膠由于表面具有硅羥基，具有一定的陽(yáng)離子交換活性,，所以可以增強(qiáng)對(duì)堿性化合物的保留,。
2，兩性離子固定相（如Syncronis HILIC）,此種固定相既有陽(yáng)離子基團(tuán),，又有陰離子基團(tuán),，二者比例1：1，因此表面靜電荷為零,。對(duì)于分析中性極性化合物是一個(gè)不錯(cuò)的選擇,。
3，酰胺鍵合相（如Accocore Amide HILIC）,通過(guò)丙基或者專(zhuān)有連接基團(tuán)將酰胺官能團(tuán)鍵合到硅膠表面,，此種鍵合相能夠提供固定相和分析物之間的強(qiáng)有力的氫鍵作用,，保留能力強(qiáng)，對(duì)于碳水化合物分析是一個(gè)不錯(cuò)的選擇,，如聚糖的分析,。酰胺鍵合相不太容易產(chǎn)生不可逆吸附（氨丙基固定相經(jīng)常會(huì)遇到這樣的問(wèn)題），同時(shí)酰胺類(lèi)色譜柱表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性,。其他的HILIC固定相包括：二醇基,、氨丙基（氨基柱）、氰丙基（氰基柱）以及其他專(zhuān)有的特殊官能團(tuán)鍵合相,。
HILIC 的優(yōu)勢(shì)及不足
通過(guò)上面我們介紹到的HILIC的機(jī)理及流動(dòng)相和固定相的特征我們不難得出HILIC在分析極性化合物方面的優(yōu)勢(shì),。首先,，HILIC機(jī)理對(duì)于幾乎所有的極性化合物都有較好的保留，大大解決了我們分析極性化合物時(shí)遇到的難以保留的問(wèn)題,。其次,，由于HILIC流動(dòng)相有機(jī)相比例很高，所以對(duì)于質(zhì)譜檢測(cè)器來(lái)說(shuō),，可以確保去溶劑化,，大大提高化合物的信噪比。另外,，較高的有機(jī)相比例組成也會(huì)帶來(lái)更低的色譜柱壓力,，在這個(gè)基礎(chǔ)上，我們采用小粒徑或者小內(nèi)經(jīng)的色譜柱時(shí)就不會(huì)受到壓力的困擾,。
HILIC的優(yōu)勢(shì)是很明顯的,，但是對(duì)于任何一種分離手段，也都存在一些不足之處,。由于HILIC保留機(jī)理比較復(fù)雜,，所以在方法優(yōu)化及色譜柱選擇上會(huì)比普通反相色譜柱要復(fù)雜。HILIC保留機(jī)理由于需要形成富水層,，所以色譜柱平衡時(shí)間會(huì)稍長(zhǎng),，建議是普通反相的2-3倍，當(dāng)然,，這個(gè)問(wèn)題其實(shí)在反相采用離子對(duì)試劑分析的時(shí)候也會(huì)碰到,。另外，由于極性化合物在水中的溶解性好,，但是如果我們采用純水相來(lái)溶劑樣品的話(huà),，有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)帶來(lái)的色譜峰展寬，就如同我們反相分析時(shí)用純有機(jī)相溶解樣品有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似的問(wèn)題,。所以,，建議采用純有機(jī)相或者與流動(dòng)相比例接近的溶劑來(lái)溶解樣品。
通過(guò)以上關(guān)于HILIC的介紹,，相信大家對(duì)HILIC有了更進(jìn)一步的了解,。在以后我們分析極性化合物方面又多了一個(gè)更有力的工具！