S-腺苷甲硫氨酸(SAM)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒技術(shù)解析與應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。在預(yù)包被抗S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中,，加入S-腺苷甲硫氨酸（SAM）校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入HRP標(biāo)記的S-腺苷甲硫氨酸（SAM）抗原（酶標(biāo)抗原）,，經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物,。加底物A和B,，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物,，在終止液（2M 硫酸）作用下,，最終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值）,，吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的濃度負(fù)相關(guān),。擬合校準(zhǔn)品曲線(xiàn)，可以計(jì)算出樣本中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的濃度,。

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒技術(shù)解析與應(yīng)用

摘要

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)是生物體內(nèi)重要的甲基供體,，參與多種生化反應(yīng)。本文詳細(xì)介紹了SAM競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒的工作原理,、實(shí)驗(yàn)流程,、技術(shù)特點(diǎn)及應(yīng)用領(lǐng)域，為研究人員提供全面的技術(shù)參考,。

1. 引言

S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作為生物體內(nèi)關(guān)鍵的甲基供體,，在DNA甲基化、神經(jīng)遞質(zhì)合成,、磷脂代謝等過(guò)程中發(fā)揮重要作用,。準(zhǔn)確測(cè)定SAM水平對(duì)于研究甲基化代謝、肝臟疾病,、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有重要意義,。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA以其高特異性、高靈敏度和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì),，成為檢測(cè)SAM的重要工具,。

2. SAM競(jìng)爭(zhēng)法ELISA試劑盒工作原理

競(jìng)爭(zhēng)法ELISA基于以下原理：

1. 微孔板預(yù)先包被SAM類(lèi)似物或結(jié)合蛋白

2. 樣品中的SAM與酶標(biāo)記的SAM競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限數(shù)量的抗體結(jié)合位點(diǎn)

3. 樣品中SAM濃度越高，與抗體結(jié)合的酶標(biāo)SAM越少

4. 加入底物顯色后,，通過(guò)測(cè)定吸光度值,，其強(qiáng)度與樣品中SAM濃度呈反比

反應(yīng)公式可表示為：

[Ab] + [SAM*] + [SAM] ? [Ab-SAM*] + [Ab-SAM]

其中Ab為抗體，SAM*為酶標(biāo)SAM,，SAM為待測(cè)樣品中的SAM試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度,，不得使用過(guò)期試劑盒。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：120,、60,、30,、15、7.5,、0 ng/mL.

其他用品

1,、 酶標(biāo)儀（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸頭

3,、 蒸餾水

4,、 洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6,、 500ml量筒

樣品的采集和儲(chǔ)存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南,。所有樣本采集保存過(guò)程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑,。

1,、 細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物,，上清液保存在- 20℃以下,，避免反復(fù)凍融。

2,、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min,，小心地分離出血清,，保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融,。

3、 血漿：肝素,，EDTA,，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清,，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融,。

樣本收集后,，無(wú)法一次檢測(cè)完畢，請(qǐng)按一次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融,，使用時(shí)在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍,。

4,、 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱(chēng)重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,，取上清檢測(cè),。

5、 細(xì)胞提取液：貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗,，然后用胰蛋白酶消化,，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集,。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次,。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過(guò)反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘,，取上清檢測(cè),。  

6、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片,。取上清檢測(cè)。

試劑準(zhǔn)備

1,、 使用前,，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫60min，確保充分復(fù)溫到室溫,。

2,、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生,，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶溶解,。濃縮洗滌液與蒸餾水,，按1:20稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水,。

3,、 底物：底物液A和B,，在使用前，按1:1體積充分混合,，混合后15分鐘內(nèi)使用,。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品,、質(zhì)控品和樣品,，建議做復(fù)孔。

1,、 按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2,、 從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、空白孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，空白孔不加,，樣本孔加待測(cè)樣本50μL,。

3、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL。

4,、 用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5,、 揭開(kāi)封板膜,，棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置20S,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)5次,。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡30s的程序,，可以提高檢測(cè)的精度,。洗板結(jié)束,，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上,，充分拍干反應(yīng)板,。

6、 將底物A和B按1:1體積充分混合,，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min,。

7,、 所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）,。

結(jié)果計(jì)算

1,、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo),，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線(xiàn)擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程,，通過(guò)樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的濃度值。

2,、 如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測(cè)的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度,。

試劑盒性能指標(biāo)

1,、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,，無(wú)破損漏氣。

2,、劑量反應(yīng)曲線(xiàn)線(xiàn)性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)r值,，大于等于0.9900。

3,、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高,、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%,。

4,、靈敏度

檢出劑量小于0.1 ng/mL。

5,、回收率

三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評(píng)估,，回收率在85%-115%之間。

6,、特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組S-腺苷甲硫氨酸（SAM）,，與結(jié)構(gòu)類(lèi)似物無(wú)交叉。

7,、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存,，有效期6個(gè)月。

8,、 檢測(cè)范圍

3.75 ng/mL - 120 ng/mL