l 本試劑盒用于體外定量檢測血清,、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中小鼠腎母細(xì)胞過度表達(dá)基因(NOV/CCN3)的含量,。

l 有效期：6個月

l 保存條件：2-8℃

試劑盒組成：

備注：

1. （96T/48T）打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全,。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：2400、1200,、600,、300、150,、0 pg/ml

3. 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗,，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可,。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時,，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進行適當(dāng)稀釋后再進行實驗,。

檢測前準(zhǔn)備工作：

1. 請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫,。

2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象,；放置室溫,，輕搖均勻，待結(jié)晶溶解后再配置洗滌液,?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃

3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。。

實驗原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預(yù)先包被小鼠腎母細(xì)胞過度表達(dá)基因(NOV/CCN3)捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠腎母細(xì)胞過度表達(dá)基因(NOV/CCN3)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計算樣品濃度。

實驗所需自備試驗器材：

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

4. 蒸餾水或去離子水

樣本處理及要求：

1. 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時或4℃過夜,，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可,，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,，并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

3. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比,，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄,。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨,。為了進一步裂解組織細(xì)胞,，可以對勻漿液進行超聲破碎,，或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測,。

4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請1000×g離心20分鐘,，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

5. 其它生物標(biāo)本：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測,。

6. 樣品外觀：樣品應(yīng)清澈透明,，懸浮物應(yīng)離心去除。

7. 樣品保存：樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的可保存于4℃,，若不能及時檢測,，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內(nèi)檢測）,，或-80℃（6個月內(nèi)檢測）,，避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測,。

注意事項：

1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑,。

2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉,。

3. 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用,。

5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。

6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射,。

7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。

8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性,。

9. 不能使用過期產(chǎn)品,。

10. 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好,，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。

實驗結(jié)果計算：

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程,，計算出樣品的濃度,。

試劑盒性能：

1. 檢測范圍：10.0 pg/ml –2400 pg/ml。

2. 靈敏度：檢測濃度小于10.0 pg/ml,。

3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% ,。