小鼠甲狀腺素（T4）定量檢測(cè)試劑盒（ELISA）操作方法

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。在預(yù)包被抗小鼠甲狀腺素（T4）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中,，加入小鼠甲狀腺素（T4）校準(zhǔn)品和待測(cè)樣本，再加入HRP標(biāo)記的小鼠甲狀腺素（T4）抗原（酶標(biāo)抗原）,，經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標(biāo)抗原的免疫復(fù)合物,。加底物A和B,，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物,，在終止液（2M 硫酸）作用下，最終轉(zhuǎn)化為黃色,，在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)上測(cè)定吸光度（OD值）,，吸光度（OD值）與待測(cè)樣品中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度負(fù)相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計(jì)算出樣本中小鼠甲狀腺素（T4）的濃度,。

試劑盒限制性

1,、 僅供科研使用，不得用于臨床診斷,。

2,、 在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過(guò)期產(chǎn)品不得使用,。

3,、 跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4,、 使用試劑盒配套的樣品稀釋液,。

5、 如果樣本值高于最高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值,，請(qǐng)將樣本適當(dāng)稀釋后,，再重新測(cè)定。

6,、 待測(cè)樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果,，檢測(cè)前，請(qǐng)排出該因素,。

7,、 通過(guò)其他方法得到的檢測(cè)結(jié)果，與本試劑盒測(cè)定結(jié)果不具有直接的可比性,。

技術(shù)提示

1,、 混合蛋白溶液時(shí)，避免起泡,。

2,、 加校準(zhǔn)品與樣本時(shí)，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣,，避免交叉污染。

3,、 合適的溫育時(shí)間,，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件,。

4,、 使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，加入一個(gè)30秒浸泡的步驟,，可以提高檢測(cè)精度,。

5,、 底物溶液為無(wú)色液體，保存過(guò)程中變?yōu)樗{(lán)色,，代表底物溶液已經(jīng)失效,，不得使用。

6,、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物,，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色,。

7、 實(shí)驗(yàn)中,，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。

8,、 所有液體組分，使用前充分搖勻,，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)標(biāo)明的時(shí)間,、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度,，不得使用過(guò)期試劑盒,。

標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：64、32,、16,、8、4,、0 ng/mL.

其他用品

1,、 酶標(biāo)儀（450nm）

2、 精密移液器及一次性吸頭

3,、 蒸餾水

4,、 洗瓶或者自動(dòng)洗板機(jī)

5、 37℃水浴鍋或恒溫箱

6,、 500ml量筒

生物安全

1,、 檢測(cè)必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染,，所有樣品,、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

2,、 試劑盒的液體組分中,，含有proclin-300防腐劑,，可能引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸,。

3、 底物液對(duì)皮膚,、眼睛和上呼吸道有刺激作用,，避免吸入煙霧。

4,、 戴上防護(hù)手套,，實(shí)驗(yàn)完成后洗手。

樣品的采集和儲(chǔ)存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南,。所有樣本采集保存過(guò)程中,，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1,、 細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min,，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

2、 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激,，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清,，保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融。

3,、 血漿：肝素,，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑,。在4000rpm條件下,，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

樣本收集后，無(wú)法一次檢測(cè)完畢,，請(qǐng)按一次用量分裝凍存,，避免反復(fù)凍融，使用時(shí)在室溫下解凍,，確保樣品均勻充分解凍,。

4,、 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液,，稱重后將組織剪碎,。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比，比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9 mL的PBS,，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,，在冰上充分研磨,。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復(fù)凍融,。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,，取上清檢測(cè)。

5,、 細(xì)胞提取液：貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗,，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞,；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集,。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μLPBS重懸并通過(guò)反復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積),。將提取液于1500×g離心10分鐘,，取上清檢測(cè)。  

6,、 其他生物體液：1000×g 離心20分鐘,，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清檢測(cè),。

試劑準(zhǔn)備

1,、 使用前，所有的組分都要至少?gòu)?fù)溫60min,，確保充分復(fù)溫到室溫,。

2、 濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液,，會(huì)有結(jié)晶產(chǎn)生,，這屬于正常現(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶溶解,。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋,，即1份的濃縮洗滌液,，添加19份的蒸餾水,。

3、 底物：底物液A和B,，在使用前,，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用,。

操作程序

所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,，建議做復(fù)孔。

1,、 按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法,，配制好試劑盒各種組分的工作液。

2,、 從鋁箔袋中取出所需板條,，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔,、空白孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，空白孔不加,，樣本孔加待測(cè)樣本50μL,。

3、除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL。

4,、 用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5,、 揭開(kāi)封板膜,，棄去液體，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液,，靜置20S，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)5次。若使用自動(dòng)洗板機(jī),，請(qǐng)按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,，添加浸泡30s的程序,，可以提高檢測(cè)的精度。洗板結(jié)束,，加底物前,，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板,。

6,、 將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL,。用封板膜蓋住反應(yīng)板,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7,、 所有孔加入終止液50μL,，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

結(jié)果計(jì)算

1,、 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為橫坐標(biāo),，對(duì)應(yīng)的吸光度（OD值）作為縱坐標(biāo)，利用計(jì)算機(jī)軟件,，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl）,，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過(guò)樣本的吸光度（OD值）,，利用方程計(jì)算樣品的濃度值,。

2、 如果樣品被稀釋,，通過(guò)上述方法測(cè)的濃度值,，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的最終濃度,。

試劑盒性能指標(biāo)

1,、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物,。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝,，無(wú)破損漏氣。

2,、劑量反應(yīng)曲線線性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值,，大于等于0.9900。

3,、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高,、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估,。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%,。

批間精密度：三組已知的高、中,、低濃度樣品,，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。批間變異系數(shù)CV%小于15%,。

4,、靈敏度

小于0.1 ng/mL。

5,、回收率

三組已知的高,、中、低濃度樣品,，進(jìn)行五次在同一個(gè)板塊內(nèi)回收率評(píng)估,，回收率在85%-115%之間。

6,、特異性

本試劑盒識(shí)別天然和重組小鼠甲狀腺素（T4），與結(jié)構(gòu)類似物無(wú)交叉,。

7,、穩(wěn)定性

2℃-8℃保存，有效期6個(gè)月,。

8,、 檢測(cè)范圍

2 ng/mL - 64 ng/mL