在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng),，即加酶結(jié)合物和顯色劑后,。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間,，這一保溫過(guò)程稱為溫育(incubation),，有人稱之為孵育。

溫育的時(shí)間選擇

溫育這一步是ELISA測(cè)定中容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟,。目前國(guó)內(nèi)ELISA試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘-1小時(shí),，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時(shí)才能有較*的結(jié)合，低于1小時(shí),，可能會(huì)影響測(cè)定下限。

ELISA屬固相免疫測(cè)定,，抗原,、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程,，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn),。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育,。

溫育所需時(shí)間與溫度成反比,，即溫度越高，則所需時(shí)間相對(duì)較短,。

溫育的溫度選擇

溫育常采用的溫度有43℃,、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí),，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí),，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng),，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度,?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜,，以形成多的沉淀,。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用,。

溫育的方式選擇

溫育方式常采用溫箱法,、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（“邊緣效應(yīng)”即外周孔顯色較中心孔深）,?？蓪LISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面,，使溫度迅速平衡,，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋,，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔,，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

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若用溫箱,，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi),，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，后將ELISA板放在濕紗布上,。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度,，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差,，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫,，這個(gè)過(guò)程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙，以免蒸發(fā),。

無(wú)論是水浴還是濕盒溫育,，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡,。室溫溫育的反應(yīng),，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃,，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書的要求控制溫育,。

室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可,。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確,。為保證時(shí)間精確，一個(gè)人一次不宜多于兩塊板同時(shí)操作,、測(cè)定,。

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關(guān)于溫育，在實(shí)際測(cè)定操作中應(yīng)注意

不同的溫育環(huán)境對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響,，操作中應(yīng)嚴(yán)格按照說(shuō)明書控制溫育時(shí)間及溫度,，并注意封閉避免邊緣效應(yīng)。

為確保各板溫度都能迅速達(dá)到平衡,，不可將反應(yīng)板疊加放置,，設(shè)定的溫度及時(shí)間嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行，一般加入待測(cè)標(biāo)本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環(huán)境下溫育,。因?yàn)楹芏嗪銣叵涞臉?gòu)造,，溫度及檢測(cè)的溫度并非酶標(biāo)板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時(shí)建議將溫度計(jì)置于酶標(biāo)板旁,，保證酶標(biāo)板旁溫度為37℃,。

干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫,，注意將固相板放入水中,，防止受熱不均勻。

試劑盒一般設(shè)定的反響溫度為 37℃,，在這個(gè)溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會(huì)許多,，對(duì)于全部反響體系來(lái)講,，各種反響物的濃度會(huì)不斷添加,，這么必會(huì)致使反響畢竟的值添加，溫育時(shí)貼封片或加蓋,，避免標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā),，吸附于孔壁。

試劑盒斷定的一定溫度下的反響時(shí)間并不是反響的完畢,，添加反響的溫度,，會(huì)加速反響，一樣添加時(shí)間會(huì)延伸反響,，這么得到的反響程度會(huì)比試劑盒斷定的反響程度多,，也會(huì)引起陰性高值或假陽(yáng)性。

實(shí)驗(yàn)操作的嚴(yán)謹(jǐn)性與實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范密不可分,，未使用的試劑應(yīng)儲(chǔ)存于2-8℃,，使用時(shí)應(yīng)回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的試劑混合使用,，要經(jīng)常檢查酶標(biāo)儀和微量移液器的精度和準(zhǔn)備度……  ELISA看起來(lái)很簡(jiǎn)單,，但是在實(shí)際操作過(guò)程中，絕不能掉以輕心,，除了嚴(yán)謹(jǐn)規(guī)范的實(shí)驗(yàn)操作,，高品質(zhì)的試劑盒與專業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)也是獲得準(zhǔn)確結(jié)果的保證！