本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）的含量,。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）水平。用純化的人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體,，往包被的微孔中依次加入人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK），再與HRP標記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中人磷酸化酪氨酸激酶（p-TrK）含量,。

試劑盒組成：

注：標準品濃度依次為：2000、1000,、500,、250、125,、0 pg/mL.

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應再次離心。

2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清,。檢測細胞內(nèi)的成份時,，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右,。通過反復凍融,，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心,。

5. 組織標本：切割標本后,，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,，其余冷凍備用,。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應盡快進行實驗,。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存,，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的加樣：設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）,、待測樣品孔,。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部,，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻,。
3. 加酶：每孔加入酶標試劑100μl,，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘,。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去,，如此重復5次,，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl,，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）,。
9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行,。

注意事項：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完,，板條應裝入密封袋中保存,。
2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果,。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性,，以避免試驗誤差,。一次加樣時間zui好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4. 請每次測定的同時做標準曲線,，zui好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染,。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行,，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8. 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用,。

10. 如與英文說明書有異,，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標,，OD值為縱坐標,，   

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標準曲線查出相應的濃度,；再乘以稀釋      

倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標     

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值     

代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋      

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度,。                 

（此圖僅供參考）

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上,。

2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應分別小于10%和15% 。

檢測范圍：                                              

62.5 pg/mL - 2000 pg/mL

靈敏度：                                              

低檢測濃度小于10 pg/mL

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存： 2-8℃,。

2．有效期： 6個月