核酸分離純化實(shí)驗(yàn)技術(shù)指南:
總RNA提取常見問題分析
RNA降解
1. 新鮮細(xì)胞:如果試劑沒有問題,,且外源性污染也可以排除,那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足,。如 果將裂解液直接加入培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞,,一定要使裂解液能覆蓋住細(xì)胞。
2. 新鮮組織:某些富含內(nèi)源核酸酶的樣品(如肝臟,,胸腺等),,即使使用電動(dòng)勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是:在液氮條件下將組織研碎,,并且勻漿時(shí)使用更多裂解液,。
3. 冷凍樣品:樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍,,然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經(jīng)液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中,。冷凍樣品,,即使是冷凍細(xì)胞,如果不在液氮條件下研磨碎,,而直接加入裂解液中勻漿,RNA也比新鮮樣品更容易降解,。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現(xiàn)融化,,所以研磨用具必須預(yù)冷,,在碾磨過程中要及時(shí)補(bǔ)充液氮,。樣品研碎后,,在液氮?jiǎng)倓倱]發(fā)完時(shí),,將樣品迅速轉(zhuǎn)移到含裂解液的容器中,立即混勻勻漿,。
4. 外源RNA酶的污染:試劑,器械及實(shí)驗(yàn)環(huán)境中的RNA酶進(jìn)入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),。
5. 內(nèi)源RNA酶的污染:抑制劑失效或者用量不夠,,實(shí)驗(yàn)樣品過多;勻漿時(shí)溫度過高,。
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