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杭州軒轅科技有限公司
主營產(chǎn)品： 生物納米壓痕儀,生物組織納米壓痕儀,SFA2000表面力儀 |
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2023-3-7 閱讀(1361)
一,、背景
機械負荷是工程心血管組織中組織特性的強大調(diào)節(jié)劑,。為了最終調(diào)節(jié)生化過程,，必須量化機械負荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響,。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機硅層中,，以允許心血管工程結(jié)構(gòu)的長期單軸循環(huán)機械應(yīng)變,。與未應(yīng)變構(gòu)建體相比，這些構(gòu)建體承受了兩種不同的應(yīng)變量級,，并且在生化性能,、力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面表現(xiàn)出差異。結(jié)果表明,，當組織暴露于長時間的機械刺激時，會誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)比例的膠原蛋白的產(chǎn)生,。然而,，以大應(yīng)變大小的應(yīng)變對組織的機械性能產(chǎn)生負面影響。此外,，與構(gòu)建體的深層相比,，動態(tài)應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。所提出的模型系統(tǒng)可用于系統(tǒng)地優(yōu)化工程心血管組織的培養(yǎng)方案,。
機械調(diào)節(jié)對細胞生物合成活性的影響已經(jīng)在二維和三維培養(yǎng)條件下進行了研究,，并且這種效果取決于ECM的性質(zhì)。 通過使用各種培養(yǎng)系統(tǒng)（例如縱向拉伸裝置和真空驅(qū)動裝置）刺激細胞,。 已經(jīng)進行了幾項研究,，著眼于機械刺激對復(fù)雜幾何形狀的組織重塑的影響。在定義明確的簡單幾何中進行了類似的實驗,。 塞利克塔等培養(yǎng)的,。成纖維細胞填充的膠原凝膠（管狀構(gòu)建體）在存在下精確控制變形。只有有限數(shù)量的研究集中在明確定義的機械負荷對工程心血管組織特性的影響,，其中研究了ECM的從頭形成（例如,，用細胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）,。需要對工程結(jié)構(gòu)中的組織特性進行機械控制。這需要詳細研究明確定義的加載條件對ECM合成和ECM組織的影響,，以優(yōu)化加載方案,。
二、材料和方法
細胞和組織培養(yǎng)
人隱靜脈細胞（HSVC,，肌成纖維細胞）取自一名44歲的女性,，并使用常規(guī)細胞培養(yǎng)方法生長。44細胞在由*Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基補充有10%胎牛血,，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素,。
將支架真空干燥48小時，然后暴露于紫外線下1小時,，隨后置于70%乙醇中4-5小時以獲得無菌,。讓支架干燥過夜，然后用磷酸鹽緩沖鹽水,。在細胞接種之前,，將組織培養(yǎng)基加入支架中16小時以促進細胞附著。使用纖維蛋白凝膠作為細胞載體,，將第7代的HSVC細胞接種在這些支架上,。細胞以每厘米約20萬個細胞的濃度接種隨后將組織構(gòu)建體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)（在37°C和5%CO2).組織培養(yǎng)基每3-4天更換一次，由補充有10%FBS,，1%l-谷氨酰胺,，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸。
應(yīng)變拉伸
將工程心血管構(gòu)建體培養(yǎng)3周,，包括6天無施加負荷以使細胞在接種后適應(yīng),，然后以2 Hz的頻率進行1周的動態(tài)應(yīng)變。應(yīng)用三種不同的應(yīng)變條件：0%應(yīng)變,，4%動態(tài)應(yīng)變和8%動態(tài)應(yīng)變（n = 8）,。在以4%和8%應(yīng)變的單獨樣品上進行所施加應(yīng)變的測量2周和3周（n = 6）。
機械測試
培養(yǎng)3周后犧牲構(gòu)建體,，并在1小時內(nèi)測試其機械性能（n = 6）,。從樣品中除去有機硅層，并將剩余的組織置于組織培養(yǎng)基中以滋潤樣品,。樣品的厚度和寬度使用以下命令測定 Plμ 2300 非接觸式光學(xué)圖像輪廓儀,。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進行掃描。通過對代表性區(qū)域求平均值來獲得厚度和寬度,。
組織形成的生化測定
三,、結(jié)果
循環(huán)應(yīng)變對組織性質(zhì)的影響
表征不同應(yīng)變大小對工程心血管組織特性、構(gòu)建體的切線剛度以及 DNA、GAG,、膠原蛋白和 HP 交聯(lián)量的影響（表1）被量化,。相對于未應(yīng)變的工程組織構(gòu)建體，循環(huán)菌株不會增加工程組織構(gòu)建體中每干重的DNA量,。然而,，與未過濾的組織結(jié)構(gòu)相比，機械應(yīng)變結(jié)構(gòu)體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低,。另一方面,，在兩種應(yīng)變條件下，每個三螺旋的HP交聯(lián)數(shù)量顯著增加,。4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的切線剛度等于未應(yīng)變組織結(jié)構(gòu)的剛度,，而8%應(yīng)變結(jié)構(gòu)相對于未應(yīng)變結(jié)構(gòu)和4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的剛度均顯著降低（圖）。4).
3周齡工程心血管結(jié)構(gòu)的切線剛度（MPa）作為不同應(yīng)變大小的函數(shù),。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05） 的顯著差異,，表示與 4% 加載條件 （p < 0.05） 的顯著差異++
四、討論
機械負荷是活組織內(nèi)生化過程的重要調(diào)節(jié)器,。為了調(diào)節(jié)這些生化過程,，必須量化機械負荷對工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。在這項研究中,，提出了一個實驗框架,，其中使用應(yīng)變系統(tǒng)的改編版本在一次實驗中同時對單個樣品施加各種應(yīng)變量級。系統(tǒng)可實現(xiàn)高通量的樣品,，并且易于長時間保持無菌狀態(tài),。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機硅層中，允許這些結(jié)構(gòu)的重復(fù)和單軸長期機械應(yīng)變,。這些構(gòu)建物附著在Bioflex孔（美國Flexcell Int. Corp.）上,，經(jīng)受兩種不同的應(yīng)變量級數(shù)周，與未應(yīng)變的構(gòu)建物相比,，在生化性能、機械性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面顯示出差異,。結(jié)果表明,，長時間的機械刺激誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)分數(shù)的膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善了膠原蛋白的內(nèi)在機械性能,。然而,，過大的應(yīng)變導(dǎo)致應(yīng)變對組織的機械性能產(chǎn)生不利影響。此外,，與構(gòu)建體的深層相比,，應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細胞和膠原蛋白的不同排列。
為了能夠拉伸三維工程心血管結(jié)構(gòu)，模型系統(tǒng)得到了進一步發(fā)展,。組織結(jié)構(gòu)的組成部分之一是涂有P4HB的PGA,，以前沒有表現(xiàn)出彈性材料行為。因此,，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態(tài)硅膠中,。這允許對這些工程組織進行動態(tài)拉伸。在培養(yǎng)2周（1周菌株）后驗證應(yīng)變場,，支撐有機硅層的存在導(dǎo)致工程結(jié)構(gòu)的彈性響應(yīng),，這可以通過在培養(yǎng)2周后保留最初施加的應(yīng)變的事實來說明。然而,，3周后的應(yīng)變分布無法確定為結(jié)構(gòu)與支撐有機硅層部分分離,，這大約對應(yīng)于PGA機械完整性的損失。 雖然應(yīng)變沒有確定,，但動態(tài)成分仍然存在,。這意味著受控應(yīng)變最終可以在 2.5-3 周的時間內(nèi)應(yīng)用。對不同應(yīng)變場的分析表明,，平均應(yīng)變構(gòu)成了所施加的應(yīng)變,，對無組織構(gòu)建的膜進行了驗證。然而,，組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)變分布更加不均勻,。可能,，不均勻的變形可以歸因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性,。設(shè)置的限制是組織形成（圖。5A-C）由于有機硅層存在下營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少而收縮到結(jié)構(gòu)表面,。
在本研究中,，動態(tài)應(yīng)變對增殖沒有影響。動態(tài)菌株和未菌株構(gòu)建體之間每干重的DNA量沒有差異,。以前,，在相對長期的研究中，細胞增殖不受機械負荷的影響,。2,，28，38 然而,，Mol等人,。38確實顯示出自由浮動工程心血管結(jié)構(gòu)的增殖水平升高，這些結(jié)構(gòu)不受機械約束,。必須認識到,，在這項研究中,，未應(yīng)變的結(jié)構(gòu)并非沒有壓力。HSVC屬于肌成纖維細胞表型25,，38,，這些肌成纖維細胞產(chǎn)生連續(xù)的等長張力。24 由于工程結(jié)構(gòu)被支撐硅膠層限制為收縮,，因此在結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生了內(nèi)部張力,。（肌）成纖維細胞收縮產(chǎn)生的內(nèi)部應(yīng)力足以限制細胞增殖,。
背景 當前細胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主,，這種平面培養(yǎng)與實際“動態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細胞形態(tài)學(xué),、細胞分化,、細胞間相互作用與體內(nèi)動態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細胞骨架重組,、細胞形態(tài)以及基因蛋白表達改變等,。
細胞牽張系統(tǒng)將帶來跨領(lǐng)域的創(chuàng)新：
· 動物實驗前更可靠的評估
· 干細胞分化機制
· 機械刺激力與癌癥的相關(guān)性
· 生醫(yī)材料與細胞動態(tài)特性研究
· 體外疾病微環(huán)境的快速建立
體內(nèi)活細胞存在于動態(tài)的生理環(huán)境中，受到廣泛的機械刺激,。包括拉伸,、壓縮、剪切應(yīng)力和流體靜壓力等 技 術(shù) 背 景 研究表明,，細胞機械感受器檢測這些刺激的作用并將信號傳遞到內(nèi)部,，進而對細胞活動產(chǎn)生影響 然而在一般的體外培養(yǎng)和分析條件下，細胞沒有受到來自生長環(huán)境的力學(xué)刺激,。機械刺激培養(yǎng)系統(tǒng)通過機械力刺激,，提供與體內(nèi)細胞相似的生理環(huán)境
細 胞 牽 張 培 養(yǎng) 細胞在機械牽張應(yīng)力刺激下，形態(tài)和生物學(xué)功能會產(chǎn)生相應(yīng)變化,。具體方法為將細胞懸液接種在一個具有彈性膜結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)皿中,，在細胞貼壁生長后，通過外界施加干預(yù),，使彈性膜產(chǎn)生一定程度的形變,，從而對依附于彈性膜上的細胞提供機械牽張刺激。
CellTank一體化主機 預(yù)埋橫桿式培養(yǎng)腔室
可視化圖形操作界面
優(yōu)勢 · 均勻負載
培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù),，保證每個細胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變,，非軸向方向上的次級載荷極低
· 高再現(xiàn)性
高精度步進電機保證在各種速度和拉伸比組合中實現(xiàn)一致的運動程序，機械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合,，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激
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自帶觸摸控制屏，無需電腦,。內(nèi)置ARM芯片,，高效穩(wěn)定運行的同時簡單易用
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有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實驗室分析技術(shù),，包括細胞固定和熒光成像等
設(shè)備參數(shù) 外形尺寸 350x330x110 mm主機重量 3 kg拉伸腔體 4個,，32x32 mm / 8個，20x20 mm控制模式 三角波,、正弦波,、方波及其組合最大應(yīng)變率 30%最高拉伸速率 30 mm/s最高循環(huán)頻率 2 Hz基底膜厚度 0.2 mm使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱
實驗流程 1. 細胞外基質(zhì)涂層進行預(yù)處理，將細胞接種到腔室中
2. 細胞粘附在基底上,，開始過夜培養(yǎng)過程
3. 細胞增殖后,，選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激
4. 進行細胞觀察
5. 根據(jù)實驗?zāi)繕耸斋@/處理細胞，分析凋亡率,、表達情況等
Case1：心肌纖維化的動態(tài)仿真 Case2：脂肪干細胞分化軟骨細胞
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