1.化學(xué)發(fā)光分析的基本原理

化學(xué)發(fā)光分析含有分析和化學(xué)發(fā)光分析兩個系統(tǒng)。分析系統(tǒng)是將化學(xué)發(fā)光物質(zhì)或酶作為標(biāo)記物,，直接標(biāo)記在抗原或抗體上，經(jīng)過抗原與抗體反應(yīng)形成抗原一抗體復(fù)合物。化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是在反應(yīng)結(jié)束后,，加入氧化劑或酶的發(fā)光底物，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)氧化劑的氧化后,，形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體，會發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài),，發(fā)光強度可以利用發(fā)光信號測量儀器進行檢測,。根據(jù)化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物與發(fā)光強度的關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出被測物的含量,。

2.化學(xué)發(fā)光分析法的類型

化學(xué)發(fā)光分析法根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為三大類,，即化學(xué)發(fā)光分析、化學(xué)發(fā)光酶分析

和電化學(xué)發(fā)光分析法,。

2.1 化學(xué)發(fā)光分析

化學(xué)發(fā)光分析是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體或抗原的一類測定方法,。目前常見的標(biāo)記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學(xué)發(fā)光劑。

2.1.1 魯米諾類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光分析：魯米諾類物質(zhì)的發(fā)光為氧化反應(yīng)發(fā)光,。在堿性溶液中,，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光,，其中H2o2為常用。因發(fā)光反應(yīng)速度較慢,，需添加某些酶類或無機催化劑,。酶類主要是辣根過氧化物酶(HRP)，無機類包括O3,、鹵素及Fe3 ,、Cu2 、Co2 和它們的配合物,。早期主要用于無機物和有機生物小分子的測定,，靈敏度因標(biāo)記后發(fā)光強度降低而降低。人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物,、胺類及其衍生物和苯基硼酸衍生物對體系的發(fā)光均有作用,，發(fā)光強度可1000倍，并且“本底”發(fā)光降低,，發(fā)光時間也得到延長,。這些劑的使用，使化學(xué)發(fā)光分析在蛋白,、核酸分析領(lǐng)域得到的應(yīng)用,。

2.1.2 吖啶酯類標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光分析：吖啶酯用于CLIA由于熱穩(wěn)定性不是很好，經(jīng)研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物,。在H2o2和OH一條件下,，吖啶酯類化合物能迅速發(fā)光，量子產(chǎn)率很高,，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達0.05,，吖啶酯作為標(biāo)記物用于分析，發(fā)光體系簡單,、,，不需要加入催化劑，且標(biāo)記,，本底低,。這些特點引起廣大分析診斷工作者的興趣。

2.2 化學(xué)發(fā)光酶分析

化學(xué)發(fā)光酶分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay,，cLEIA)屬酶分析,，只是酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，操作步驟與酶免分析*相同：以酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)進行反應(yīng),，反應(yīng)復(fù)合物上的酶再作用于發(fā)光底物,，在信號試劑作用下發(fā)光，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定,。目前常用的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP),，它們有各自的發(fā)光底物,。HRP常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中,，使用過氧化物酶標(biāo)記抗體,，進行反應(yīng)后，利用魯米諾作為發(fā)光底物,，在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH和H2o2)作用下魯米諾發(fā)光,，酶反應(yīng)物中酶的濃度決定了化學(xué)發(fā)光的強度。此傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光體系(HRP-H2O2-LUMINOL)為幾秒內(nèi)瞬時閃光,，存在發(fā)光強度低,、不易測量等缺點。后來,，在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光劑,，以發(fā)光信號，并在較長的時間內(nèi)保持穩(wěn)定,，便于重復(fù)測量,，從而分析靈敏度和性。

堿性磷酸酶(ALP)已用于酶聯(lián)分析和核酸雜交分析,。堿性磷酸酶和1,，2．二氧環(huán)乙烷構(gòu)成的發(fā)光體系是目前重要、靈敏的一類化學(xué)發(fā)光體系,。這類體系中具有的是ALP-AMPPD發(fā)光體系,。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定，非酶催化的水解慢,，在pHl2的0.05 mol／L碳酸鈉緩沖溶液中,，分解半衰期可達74年，幾乎沒有試劑本身的發(fā)光背景,。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物,，可用來檢測堿性磷酸酶或抗體、核酸探針及其他配基的結(jié)合物,。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有高的靈敏度,，對標(biāo)記物ALP的檢測限達10-21 mol，是靈敏的測定方法之一,。對AMPPD加以改進，獲得具有反應(yīng)動力學(xué)和更高

靈敏度的產(chǎn)物：CSPD,、CDP-Star,。這些體系已用于基因和病原體DNA的鑒定。

2.3 電化學(xué)發(fā)光分析

電化學(xué)發(fā)光分析(Electrochemiluminescence,，ECL)是指由電化學(xué)反應(yīng)引起的化學(xué)發(fā)光過程,。ECL的反應(yīng)在電極表面進行,，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ]，三丙胺(TPA)用來激發(fā)光反應(yīng),。在陽極表面,，兩種物質(zhì)同時失去電子。在電極板上Ru(byp)2+3 被氧化成Ru(byp)3+3,TPA也被氧化成陽離子自由基(TPA+# ),，TPA+#自發(fā)地釋放一個質(zhì)子而變成非穩(wěn)定分子(TPA* ),，將一個電子遞給Ru(byp)3+3，形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)2+3,。Ru(byp)3+3在衰減的同時發(fā)射一個波長為620NM的光子,，重新回到基態(tài)Ru(byp)2+3。這一過程在電極表面反復(fù)進行,，產(chǎn)生,、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光，并不斷,。

ECL的突出優(yōu)點是：①標(biāo)記分子小,，可實現(xiàn)多標(biāo)記，標(biāo)記物穩(wěn)定,；②發(fā)光時間長,，靈敏度高；③光信號線性好,，動力學(xué)范圍寬,，過6個數(shù)量級；④可重復(fù)測量,，重現(xiàn)性好,；⑤可實現(xiàn)多元檢測和均相分析；⑥,，完成一個樣品的分析通常18 min,；⑦可實現(xiàn)全自動化。由于電化學(xué)發(fā)光分析具有性,，是一種很有發(fā)展前途的分析法,，日益受到人們的重視，目前已應(yīng)用于抗原,、半抗原及抗體的檢測,。

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