1.化學發(fā)光分析的基本原理

化學發(fā)光分析含有分析和化學發(fā)光分析兩個系統(tǒng),。分析系統(tǒng)是將化學發(fā)光物質或酶作為標記物，直接標記在抗原或抗體上,，經(jīng)過抗原與抗體反應形成抗原一抗體復合物,。化學發(fā)光分析系統(tǒng)是在反應結束后,，加入氧化劑或酶的發(fā)光底物,，化學發(fā)光物質經(jīng)氧化劑的氧化后，形成一個處于激發(fā)態(tài)的中間體,，會發(fā)射光子釋放能量以回到穩(wěn)定的基態(tài),，發(fā)光強度可以利用發(fā)光信號測量儀器進行檢測。根據(jù)化學發(fā)光標記物與發(fā)光強度的關系,，可利用標準曲線計算出被測物的含量,。

2.化學發(fā)光分析法的類型

化學發(fā)光分析法根據(jù)標記物的不同可分為三大類，即化學發(fā)光分析,、化學發(fā)光酶分析

和電化學發(fā)光分析法,。

2.1 化學發(fā)光分析

化學發(fā)光分析是用化學發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類測定方法。目前常見的標記物主要為魯米諾類和吖啶酯類化學發(fā)光劑,。

2.1.1 魯米諾類標記的化學發(fā)光分析：魯米諾類物質的發(fā)光為氧化反應發(fā)光,。在堿性溶液中，魯米諾可被許多氧化劑氧化發(fā)光,，其中H2o2為常用,。因發(fā)光反應速度較慢，需添加某些酶類或無機催化劑,。酶類主要是辣根過氧化物酶(HRP),，無機類包括O3,、鹵素及Fe3 、Cu2 ,、Co2 和它們的配合物,。早期主要用于無機物和有機生物小分子的測定，靈敏度因標記后發(fā)光強度降低而降低,。人們發(fā)現(xiàn)發(fā)光體系中加入某些酚類及其衍生物,、胺類及其衍生物和苯基硼酸衍生物對體系的發(fā)光均有作用，發(fā)光強度可1000倍,，并且“本底”發(fā)光降低,，發(fā)光時間也得到延長。這些劑的使用,，使化學發(fā)光分析在蛋白,、核酸分析領域得到的應用。

2.1.2 吖啶酯類標記的化學發(fā)光分析：吖啶酯用于CLIA由于熱穩(wěn)定性不是很好,，經(jīng)研究合成了更穩(wěn)定的吖啶酯衍生物,。在H2o2和OH一條件下，吖啶酯類化合物能迅速發(fā)光,，量子產(chǎn)率很高,，如吖啶芳香酯的量子產(chǎn)率可達0.05，吖啶酯作為標記物用于分析,，發(fā)光體系簡單、,，不需要加入催化劑,，且標記，本底低,。這些特點引起廣大分析診斷工作者的興趣,。

2.2 化學發(fā)光酶分析

化學發(fā)光酶分析(Chemiluminescent enzymeimmunoassay，cLEIA)屬酶分析,，只是酶反應的底物是發(fā)光劑,，操作步驟與酶免分析*相同：以酶標記生物活性物質進行反應，反應復合物上的酶再作用于發(fā)光底物,，在信號試劑作用下發(fā)光,，用發(fā)光信號測定儀進行發(fā)光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP )和堿性磷酸酶(ALP),，它們有各自的發(fā)光底物,。HRP常用發(fā)光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中,，使用過氧化物酶標記抗體,，進行反應后,，利用魯米諾作為發(fā)光底物，在過氧化物酶和起動發(fā)光試劑(NaOH和H2o2)作用下魯米諾發(fā)光,，酶反應物中酶的濃度決定了化學發(fā)光的強度,。此傳統(tǒng)的化學發(fā)光體系(HRP-H2O2-LUMINOL)為幾秒內(nèi)瞬時閃光，存在發(fā)光強度低,、不易測量等缺點,。后來，在發(fā)光系統(tǒng)中加入發(fā)光劑,，以發(fā)光信號,，并在較長的時間內(nèi)保持穩(wěn)定，便于重復測量,，從而分析靈敏度和性,。

堿性磷酸酶(ALP)已用于酶聯(lián)分析和核酸雜交分析。堿性磷酸酶和1,，2．二氧環(huán)乙烷構成的發(fā)光體系是目前重要,、靈敏的一類化學發(fā)光體系。這類體系中具有的是ALP-AMPPD發(fā)光體系,。在溶液中AMPPD的磷酸酯鍵很穩(wěn)定,，非酶催化的水解慢，在pHl2的0.05 mol／L碳酸鈉緩沖溶液中,，分解半衰期可達74年,，幾乎沒有試劑本身的發(fā)光背景。AMPPD為磷酸酯酶的直接發(fā)光底物,，可用來檢測堿性磷酸酶或抗體,、核酸探針及其他配基的結合物。ALP-AMPPD發(fā)光體系具有高的靈敏度,，對標記物ALP的檢測限達10-21 mol,，是靈敏的測定方法之一。對AMPPD加以改進,，獲得具有反應動力學和更高

靈敏度的產(chǎn)物：CSPD,、CDP-Star。這些體系已用于基因和病原體DNA的鑒定,。

2.3 電化學發(fā)光分析

電化學發(fā)光分析(Electrochemiluminescence,，ECL)是指由電化學反應引起的化學發(fā)光過程。ECL的反應在電極表面進行,，發(fā)光底物為三聯(lián)吡啶釕[Ru(byp)2+3 ],，三丙胺(TPA)用來激發(fā)光反應。在陽極表面，兩種物質同時失去電子,。在電極板上Ru(byp)2+3 被氧化成Ru(byp)3+3,TPA也被氧化成陽離子自由基(TPA+# ),，TPA+#自發(fā)地釋放一個質子而變成非穩(wěn)定分子(TPA* )，將一個電子遞給Ru(byp)3+3,，形成激發(fā)態(tài)的Ru(byp)2+3,。Ru(byp)3+3在衰減的同時發(fā)射一個波長為620NM的光子，重新回到基態(tài)Ru(byp)2+3,。這一過程在電極表面反復進行,，產(chǎn)生、穩(wěn)定的連續(xù)發(fā)光,，并不斷,。

ECL的突出優(yōu)點是：①標記分子小，可實現(xiàn)多標記,，標記物穩(wěn)定,；②發(fā)光時間長，靈敏度高,；③光信號線性好,，動力學范圍寬，過6個數(shù)量級,；④可重復測量,，重現(xiàn)性好；⑤可實現(xiàn)多元檢測和均相分析,；⑥,，完成一個樣品的分析通常18 min；⑦可實現(xiàn)全自動化,。由于電化學發(fā)光分析具有性,，是一種很有發(fā)展前途的分析法，日益受到人們的重視,，目前已應用于抗原、半抗原及抗體的檢測,。

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