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色譜柱固定相鍵合方式及修飾方法有哪些,？
日常工作中,，經(jīng)常遇到老師咨詢硅膠單體表面的硅烷鍵合方式，是單鍵鍵合,、雙鍵鍵合還是三鍵鍵和呢,？填料表面是否有活性硅醇基，有沒有封端,？碳鏈上是否嵌入極性官能團(tuán),，是哪種官能團(tuán)？在有些項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)上,，要求固定相是堿基失活硅膠,。熟悉固定相鍵合方式及其修飾，有助于了解色譜柱的使用條件,，選擇合適的色譜柱,。
制備反相色譜柱填料常用的方法是有機(jī)硅烷和硅膠表面的硅醇基上發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，來“鍵合"生成固定相或者配合基R：
X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX
（硅烷）（硅烷醇）（最后的固定相）
HPLC柱子的制備可通過幾種不同的硅烷-硅膠反應(yīng)來實(shí)現(xiàn),。單體相是反相柱子里使用zui廣泛的技術(shù),，即一個硅烷分子和硅醇基反應(yīng)。這種一對一鍵合,，使生成的鍵合相相對完善并且具有很好的重現(xiàn)性,。這樣制作的填料通常會具有zui高的柱效，因?yàn)楣潭ㄏ鄬酉鄬Σ粨頂D,，因此溶質(zhì)分子能夠快速擴(kuò)散進(jìn)出固定相,。相反，多官能團(tuán)的,、高度聚合的固定相則表現(xiàn)出較低的溶質(zhì)擴(kuò)散速度和較低的柱效,，尤其是在流動相流速較高的情況下。
01 鍵合方式
目前單體的硅烷-硅膠鍵合技術(shù)主要分為四種：單鍵鍵合（Ultimate® XB-C18）,、雙鍵鍵合（Sunfire C18）,、三鍵鍵合（Ultimate® PAH）、雙齒鍵合（ZORBAX Extend C18）,。單鍵鍵合有利于提高傳質(zhì)速率,，加快色譜柱平衡，但在低pH條件下長期使用時(shí),，單鍵鍵合相易流失,，在色譜圖上表現(xiàn)為保留時(shí)間縮短。而使用多鍵鍵合的方式（雙鍵鍵合,、三鍵鍵合和雙齒鍵合）可以提高固定相在低pH條件下的穩(wěn)定性,。
02 硅膠封端
因?yàn)榇嬖诮Y(jié)構(gòu)位阻,，硅膠表面的硅醇基無法wan全與硅烷分子鍵合，而殘留的硅醇基,，可能與堿性化合物發(fā)生次級離子交換作用，導(dǎo)致峰形不佳,，因此常采用體積較小的TMS（如三甲基硅烷）或者其他技術(shù)封端,，使填料表面盡可能的減小殘留硅醇基。但是TMS在pH較低時(shí)容易被水解和破壞,，這會造成保留時(shí)間和選擇性發(fā)生改變,。另一方面來說，封端填料提高了色譜柱在堿性條件下的穩(wěn)定性,，降低柱流失,，并有利于色譜柱對極性和堿性化合物的分離、提供良好的峰形,。
03 空間位阻保護(hù)-側(cè)鏈烷基
在硅膠表面的十八烷基的側(cè)鏈上引入甲基,、異丙基或異丁基，可以極大程度的屏蔽硅膠表面硅醇基的作用,?？臻g保護(hù)對于低pH的分離實(shí)驗(yàn)非常有幫助，避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂,，但不能用在高pH條件下,。具有空間保護(hù)功能的固定相可以以多種配合基的形式存在（比如，C8,、C18,、氰基、苯基）,，每個配合基在流動相較低的pH條件下均能保持較高的穩(wěn)定性（pH低至0.8）,。常見該類型色譜柱如月旭Ultimate® LP系列色譜柱。
04嵌入極性基團(tuán)
一般反相色譜柱對強(qiáng)極性和強(qiáng)堿性物質(zhì)分離較差,，在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團(tuán)（如脲基,、酰胺基、醚基或甲酸酯基）,，提高對此類物質(zhì)的選擇性,，同時(shí)極性基團(tuán)屏蔽了硅膠表面的硅醇基作用，可極大改善峰形,，在測定堿性物質(zhì)時(shí)不拖尾,。典型代表如采用酰胺基團(tuán)的Ultimate® Polar-RP色譜柱。
另外碳鏈中存在極性基團(tuán),，能使固定相的親水性濕潤性增強(qiáng),，用到95%以上的高水流動相時(shí),，不會發(fā)生相塌陷。具有與普通的反相C18和C8柱不同的選擇性,，特別是對于酚類等極性物質(zhì),。