各位小伙伴在實(shí)驗(yàn)分析中應(yīng)該都遇到過這類問題，在液相色譜中,，對于組分復(fù)雜的樣品,，采用一種色譜體系，往往很難得到理想的分離效果,，要么分離時間太長,，要么分離度太差。這種情況,，采用梯度洗脫就可以縮短分析時間,，提高分離效果。下面和大家分享一則梯度微調(diào)實(shí)例,，一起感受下梯度微調(diào)對分離效果的奇妙影響吧,。
1、盡量在能長時間測試該項(xiàng)目的儀器上開發(fā)方法,；
2,、需要了解系統(tǒng)的性能，避免出現(xiàn)儀器系統(tǒng)改變后不能重現(xiàn)的問題,；
3,、要知道系統(tǒng)的兩個基本情況：梯度滯后體積和比例精確性,。這可以在同一個實(shí)驗(yàn)里得到這兩個數(shù)據(jù)：參考《JJG 705 2014液相色譜儀檢定規(guī)程》中《梯度誤差》實(shí)驗(yàn)：在B溶液（0.1%丙酮）后加紫外檢測器，設(shè)置一個多階層的梯度,，B溶液以5%的幅度從0%變到100%,，流速與平常一樣，流速為1mL/min,。每段梯度大概保持5min,。然后接二通運(yùn)行梯度，記錄圖譜,。每段梯度設(shè)置的時間與實(shí)際發(fā)生的梯度時間之差就是梯度延遲時間，階層的高度可以用來測量流動相比例,，這些階層可能有點(diǎn)模糊,，是由系統(tǒng)中混合體積造成的；
4,、檢測完系統(tǒng),，就可以按照它的性能來設(shè)計(jì)方法。梯度方法轉(zhuǎn)換大的問題是梯度滯后體積,，如果知道儀器的滯后體積比初開發(fā)方法的儀器大,，就要自覺的在方法前加一段等度來抵消這一差別，如果目標(biāo)系統(tǒng)滯后體積小,，就要在轉(zhuǎn)移方法的時候在方法開始加一段梯度延遲時間,，如果比例差別是在梯度運(yùn)行中間出現(xiàn)的，也可以通過調(diào)節(jié)梯度圖譜來抵消這種差別,，但是一般很少遇到過需要這么做的情況,。
5、初始流動相沒有充分平衡,。柱子已經(jīng)用初始流動相平衡了,，但在分析中，梯度變化很快,，而柱子沒有用初始流動相充分平衡好,，這樣di一針時總是與后面的不一樣。但是如果轉(zhuǎn)移到有不一樣滯后體積的系統(tǒng)時,，可能就是另一種情況,。
項(xiàng)目背景
名稱：12種酚類
色譜柱：月旭Ultimate ® AQ-C18 4.6mm*150mm,5μm
流動相A：水 流動相B：乙腈
問題：柱子正常活化進(jìn)樣,，基線和整體出峰均不理想,，分離度較差。
1.柱子在運(yùn)輸或儲存過程中保存液發(fā)生變化,，導(dǎo)致填料產(chǎn)生微小改變,，碳鏈蜷縮,，未舒展開來，對目標(biāo)物的保留造成影響,；
2.儀器系統(tǒng)存在梯度滯后,，在梯度變化過程中，兩相混合不精準(zhǔn),，導(dǎo)致的物質(zhì)分離問題,；
3.目標(biāo)物受溶劑效應(yīng)影響；
4.梯度變化過快,，流動相的洗脫能力太強(qiáng),，導(dǎo)致色譜峰未達(dá)到分離效果。
1.測試梯度滯后體積和比例精確性,；
2.用初始流動相0.2流速過夜平衡柱子,；
3.樣品用初始流動相溶解（慎用，改變樣品溶劑后需要驗(yàn)證樣品溶液的穩(wěn)定性）,；
4.調(diào)節(jié)梯度,，減緩洗脫速率，減小洗脫能力,；
基線和峰形大有改善,，但是后一個峰在梯度時間外出峰了。
梯度變化中,，水相速率增長較快,，物質(zhì)保留變強(qiáng)，沒有獲得足夠的洗脫能力,，后一個物質(zhì)出峰較晚,。
前段分離好的梯度不做調(diào)整，調(diào)整后一個物質(zhì)出峰梯度階段的有機(jī)相比例,，增加洗脫能力,。
以上說明，項(xiàng)目的成功與否,，不僅取決于色譜柱類型,，儀器條件，還有方法的建立,。其中流動相便是考察重點(diǎn),，流動相梯度洗脫必要時可以充分應(yīng)用上，他是由幾種不同極性的溶劑組成,，通過改變流動相中不同時間段各溶劑組成的比例改變流動相極性,，使每個流出的組分都有合適的容量因子，并使樣品的所有組分在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)佳分離,。好啦,，今天的分享就先到這,，希望能對小伙伴們有所啟發(fā)有所幫助哦。
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