染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒

Dye-quantitative Real-time PCR Kit for Mycoplasma contamination

貨號：Myco-qs-20,，規(guī)格：20個反應(yīng)

貨號：Myco-qs-20，規(guī)格：20個反應(yīng)

貨號：Myco-qs-20,，規(guī)格：20個反應(yīng)

儲存：-20度,，避光保存，保質(zhì)期一年,。避免反復(fù)凍融,。

試劑盒特點：

1， 對柔膜菌綱（包括支原體,、螺原體和無膽甾原體）有極的特異性,，與柔膜菌綱以外的其他基因組無交叉反應(yīng)。

2,， 靈敏度高,，最可檢出反應(yīng)液中2-4個基因組。

3,， 使用熱啟動的Taq酶,，可抑制非特異性擴增，降低背景熒光,。

4,， 帶有陽性對照樣品，可用于檢驗試劑盒有效性,，也可用于驗證待測樣品中是否含有PCR抑制劑,。

5， 帶有ROX參比染料,，幫助校正加樣誤差和管間差異,。

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜菌（Mollicutes）綱,也有稱為霉形體、霉?jié){菌或微漿菌,，直徑約0.1-0.3 µm,具有變形能力,，因此可以輕易穿過常規(guī)的0.22 µm無菌濾膜,是常見的動物細胞培養(yǎng)污染源。由于支原體體積太小,，在光學(xué)顯微鏡下不可分辨，因此細胞常常在不知不覺中被污染。

目前的經(jīng)典檢測方法是歐洲藥典（European Pharmacopeia）2.6.7規(guī)定的體外培養(yǎng)法,，用特殊培養(yǎng)基對支原體進行培養(yǎng),，以此檢測污染情況。培養(yǎng)法的優(yōu)點是檢測靈敏度高,，缺點是耗時較長,，最長的需要28天之久，而且受操作人員的技能水平影響較大,，不同實驗室的檢測誤差較大,。隨著生物制藥業(yè)的發(fā)展，很多生物制品保質(zhì)期較短,，因此需要一種快速,、靈敏并且特異性強的支原體檢測方法。歐洲藥典因此接納了核酸檢測方法作為培養(yǎng)法的替代方案,。定量PCR法可以在幾個小時內(nèi)完成檢測,，靈敏度與培養(yǎng)法相當，甚至更好,。

本試劑盒以16S rRNA基因為靶點,，設(shè)計了多對引物，可檢出絕大部分已知的支原體,，以及部分螺原體和無膽甾原體,，與親緣關(guān)系較近的革蘭氏陽性菌，如鏈球菌,、梭菌,、乳桿菌等，沒有交叉反應(yīng),，在檢測范圍和特異性方面達到歐洲藥典的要求,。歐洲藥典提及的所有支原體均在本試劑盒的檢測范圍內(nèi)。靈敏度方面,，最-低檢測值可以達到每個反應(yīng)2-4個基因組,，在不考慮DNA提取損耗的情況下，達到歐洲藥典要求的10 CFU/mL的最-低檢測值,。本試劑盒可作為支原體通用檢測試劑盒使用,，但不適用于嗜血支原體的檢測。

本試劑盒包含熱啟動Taq酶,、dNTP（以UTP代替了TTP）,、引物、陽性對照品,、SYBR Green I染料,、ROX染料,，和用以防止殘余DNA污染的UDG（尿嘧啶-N-糖苷酶），用戶只需準備好DNA樣品即可使用,。

注意事項：

1,，     本產(chǎn)品僅限于科研使用，不作診斷用途,。

2,，     操作過程中應(yīng)注意防范樣品之間的串聯(lián)污染。建議對工作區(qū)域進行劃分,，將不同步驟,，如DNA提取和PCR反應(yīng)液的配制，分開在不同階段不同區(qū)域進行,。使用無污染的一次性槍頭,，建議用帶濾芯的槍頭。建議在通風(fēng)區(qū)域操作,，操作時須佩戴無粉塵手套,。

相關(guān)小知識：

熱啟動Taq酶是結(jié)合了特異性單克隆抗體的DNA聚合酶，在室溫下聚合酶活性被抗體抑制,。在PCR循環(huán)的變性階段,，抗體受熱被去除，聚合酶活性恢復(fù),，因此獲得“熱啟動"功能,。“熱啟動"功能可降低PCR的背景擴增,，減少殘余DNA的污染,，提高PCR擴增效率、靈敏度和目的片段產(chǎn)量,。

SYBR Green I可以與DNA雙鏈的小溝結(jié)合,，結(jié)合后在497nm激發(fā)光照射下產(chǎn)生520nm的發(fā)射光。未結(jié)合雙鏈DNA的SYBR Green I基本不產(chǎn)生熒光,。因此可以根據(jù)熒光值的大小判斷溶液內(nèi)DNA雙鏈的多寡,，用于實時檢測PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)物的累積量。初始模板濃度越高,，反應(yīng)循環(huán)數(shù)越高,，則雙鏈DNA含量越高，熒光值也就越高,。值得注意的是,，SYBR Green I也可以結(jié)合非特異性PCR產(chǎn)物以及引物二聚體，此時產(chǎn)生的熒光與目標擴增產(chǎn)物無法區(qū)分,。為了判斷熒光信號是否來自目標擴增產(chǎn)物,，可以繪制熔解曲線,。通過逐步緩慢升溫，使雙鏈DNA解離為單鏈DNA,，同時檢測熒光值的變化,，繪制曲線，根據(jù)熒光值觀察DNA解鏈的溫度,。

UDG和dUTP可以阻止前次步驟殘余DNA的擴增。dUTP可以確保擴增后的DNA中均含有尿嘧啶,。UDG可從單鏈或雙鏈DNA上去除尿嘧啶殘基,，從而阻止含有尿嘧啶的DNA作為下幾輪PCR的模板。在PCR循環(huán)開始前的UDG孵育步驟,，可以破壞帶有尿嘧啶的PCR產(chǎn)物,。經(jīng)過該去除污染步驟后，UDG在正常的PCR循環(huán)過程中被高溫滅活,，對PCR反應(yīng)沒有影響,。

ROX不參與PCR反應(yīng)，在PCR反應(yīng)過程中熒光沒有變化,，可以提供一條基線用于校正加樣誤差和管間差異,，便于儀器自動分析報告熒光與內(nèi)參ROX熒光的比值，使定量更準確,。ROX染料的激發(fā)波長為584nm,，發(fā)射波長為612nm。用ROX進行校正后可以使實驗誤差減小十倍左右,。

相關(guān)產(chǎn)品：

支原體污染PCR檢測試劑盒,，貨號： Myco-P-20，Myco-P-50,，Myco-P-100

染料法支原體污染實時定量PCR試劑盒,，貨號： Myco-qs-20，Myco-qs-50,，Myco-qs-100

探針法支原體污染實時定量PCR試劑盒,，貨號： Myco-qt-20，Myco-qt-50,，Myco-qt-100

支原體清除劑,，貨號：Myco-E-h，Myco-E-1,，Myco-E-5