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Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述
　　細胞凋亡的一個顯著特點是細胞染色體 DNA 的降解,，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律,，所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp的整數(shù)倍,，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜，Biotin TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit試劑盒采用TUNEL 法,，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 在凋亡細胞斷裂DNA 的 3´-OH 末端催化摻入生物素(Biotin)標記的dUTP(Biotin-X-dUTP),。隨后和辣根過氧化物酶(HRP)標記的Streptavidin (Streptavidin-HRP)特異結(jié)合，后在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,，從而可以通過普通光學顯微鏡觀察并計數(shù)凋亡細胞,。由于正常的或正在增值的細胞幾乎沒有DNA的斷裂,，因而沒有3´-OH 形成，很少能被染色,。TUNEL 法可以選擇性的對凋亡細胞直接進行原位檢測,， 而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞，是一種更快速,、直接的檢測手段,。
訂購信息
 

產(chǎn)品組分
 

 
保存方法
　　本產(chǎn)品應(yīng)避光置于-20℃儲存； TUNEL Reaction Buffer 避光儲存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,。有效期見外包裝。
【注】：TUNEL EquiLibration Buffer,、 TUNEL Reaction Buffer和DAB顯色液中含有有毒,、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate、Cobaltous chloride以及3,3'-Diaminobenzidine ( DAB),，使用時請佩戴口罩,、手套，接觸皮膚后,，請立即有大量水沖洗,，廢液請按有毒物質(zhì)處理。
實驗材料（自備）
PBS 緩沖液（ pH～7.4）
4% 多聚甲醛in PBS
0.3% H2O2  in PBS（新鮮配制）
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
操作步驟
 

1. 樣本準備：
     細胞樣品
   （1）可選：準備一份陰性對照樣本（加入不含TdT酶的TUNEL 反應(yīng)液）,。
   （2）PBS 清洗細胞兩次,。
   （3）細胞固定：加入適量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液， 4℃ 放置 30 min,。
   （4）PBS清洗細胞兩次,。
   （5）通透細胞：加入冰上預(yù)冷的 70%乙醇，在-20℃孵育 4 h,。細胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周,。或者細胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透,，室溫放置 20 min,。
   （6）PBS 清洗細胞兩次。
   （7）封閉細胞：每孔加入100μL左右的配制于PBS中的0.3 % H2O2溶液,，輕敲孔板使其充分覆蓋細胞,，室溫避光封閉 30 min,，用1×PBS清洗細胞2次,。
   石蠟組織切片
   （1）室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min,，以*脫掉石蠟,。
   【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請在通風櫥中進行此操作,。
   （2）室溫下,，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次，每次5 min,。
   （3）室溫下,，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%、90%,、80%,、70%）中，每種濃度各漂洗1次,，每次5 min,。
   （4）室溫下，將切片浸沒于純水中漂洗1次,，每次3 min,，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次，每次3 min,，用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體,。
   （5）用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓，以便下游通透與標記,。
   （6）按1:100的比例,，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋，使其終濃度為20 µg/mL,。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液,，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育20 min（Proteinase K的孵育時間,、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）,。
   【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織,，但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落,，所以要優(yōu)化孵育時間長短,。時間一般為10~30 min,，4 µm左右的片子可以用10 min,，但30 µm左右的可用30 min,。過長易脫片,、過短起不到通透效果,。
   （7）PBS浸潤清洗切片兩次,，每次5 min,。
   （8）封閉：加入適量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鮮配制），室溫孵育 30 min,，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶,。
   （9）PBS浸潤清洗切片兩次,，每次5 min，用濾紙吸去多余的液體,，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤,。
   冰凍切片
   （1）將冰凍切片放置于室溫的片架上，室溫20 min,，晾干,。
   （2）將載玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（in PBS）中，室溫固定30 min,。
   （3）PBS 浸潤清洗切片兩次,，每次5 min。
   （4）用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體,。
   （5）按1:100的比例,， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋， 使其終濃度為20 µg/mL,。每個樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液,，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫孵育10 min（Proteinase K 的孵育時間,、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進行優(yōu)化）,。
   【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導(dǎo)致切片脫落,，所以要優(yōu)化孵育時間長短,。時間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min,，但30 µm左右的可用30 min,。過長易脫片、過短起不到通透效果,。
   （6）PBS浸潤清洗切片兩次,，每次5 min。
   （7）封閉：加入適量配制于 PBS 中的 0.3% H2O2溶液（新鮮配制）,，室溫孵育30 min,，以滅活切片內(nèi)源的過氧化氫酶。
   （8）PBS清洗樣品3次,，每次5min,，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤,。
   陽性處理(僅陽性對照進行此步驟,，其他樣品直接進行TUNEL反應(yīng)步驟)
   （1）按1:10的比例用diH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用。
   （2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上,，室溫平衡5 min,。
   （3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL)，使其為終濃度20 U/mL的工作液,。
   （4）輕輕吸掉多余液體,，加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液，室溫孵育10 min,。
   （5）輕輕吸掉多余液體,，PBS清洗樣品2次。
   2. TUNEL 反應(yīng)：
   （1）配制TUNEL反應(yīng)液（即用即配）,。

（2）每個樣品加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)液,，37℃避光孵育 60 min，組織樣本需要 2 h（陰性對照樣品加入不含 TdT 酶的TUNEL 反應(yīng)液）,。
【注】：50μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片,、切片或96孔板、48孔板,、 24孔板或12孔板的一個孔,，如果是6孔板中的一個孔TUNEL反應(yīng)液建議使用100μL。如果待檢測的樣品為涂片,、切片或在24 孔板,、12孔板或6孔板中，建議在滴加TUNEL反應(yīng)液后在樣品上覆上防蒸發(fā)膜,，防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā),，并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣品。
（3）PBS清洗反應(yīng)后的樣品3次,，每次5 min,。
3. Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液的配制：
（1）Streptavidin-HRP工作液的配制（即用即配）：
 

注意事項
1. 該產(chǎn)品*于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷,、治療等領(lǐng)域,。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。
3. die dan hua na對HRP有抑制作用,，實驗中請勿使用含有die dan hua na的試劑。
常見問題與分析