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Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述
　　細(xì)胞凋亡的一個(gè)顯著特點(diǎn)是細(xì)胞染色體 DNA 的降解，這是一個(gè)較普遍的現(xiàn)象,。這種降解非常特異并有規(guī)律,，所產(chǎn)生的不同長度的 DNA 的片段約為 180 bp-200 bp 的整數(shù)倍，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)特異的梯狀 Ladder 圖譜,，Cy3 TUNEL Assay Apoptosis Detection Kit試劑盒采用 TUNEL 法,，應(yīng)用末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)在凋亡細(xì)胞斷裂DNA 的3´-OH末端催化摻入Cy3-dUTP。 Cy3-dUTP標(biāo)記的 DNA 可以用熒光顯微鏡直接觀察或者用流式細(xì)胞儀定量,。 TUNEL 法可以選擇性的檢測(cè)凋亡細(xì)胞,， 而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細(xì)胞。TUNEL 實(shí)驗(yàn)中,， TdT 酶催化 dUTP 摻入斷裂的 DNA 鏈的3´-OH末端,。抗原標(biāo)記的 dUTP（如digoxin-dUTP,、生物素-dUTP）,，因?yàn)樗梢灾苯舆M(jìn)行原位檢測(cè)，是一種更快速,、直接的檢測(cè)手段,。
訂購信息
 

產(chǎn)品組分
 

保存方法
　　本產(chǎn)品應(yīng)置于-20℃儲(chǔ)存；TUNEL Reaction Buffer 避光儲(chǔ)存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,。有效期見外包裝。
【注】：TUNEL Equilibration Buffer和TUNEL Reaction Buffer中含有有毒,、致癌成分Sodium cacodylate trihydrate和Cobaltous chloride,，使用時(shí)請(qǐng)佩戴口罩、手套,，接觸皮膚后,，請(qǐng)立即有大量水沖洗，廢液請(qǐng)按有毒物質(zhì)處理,。
實(shí)驗(yàn)材料（自備）
PBS 緩沖液（pH～7.4）
4%多聚甲醛（in PBS）
牛血清白蛋白(BSA) 或正常的羊,、牛血清
70%乙醇（自選）
脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）
蛋白酶K（石蠟切片樣本）
操作步驟
1.樣本準(zhǔn)備：
細(xì)胞樣品
（1）可選：準(zhǔn)備一份陰性對(duì)照樣本（加入不含 TdT 酶的TUNEL 反應(yīng)液）,。
（2）PBS清洗細(xì)胞兩次。
（3）細(xì)胞固定：加入適量 4%多聚甲醛(pH 7.4)溶液,， 4℃ 放置 30 min,。
（4）PBS清洗細(xì)胞兩次。
（5）通透細(xì)胞：加入冰上預(yù)冷的 70%乙醇,，在-20℃孵育 4 h,。細(xì)胞能在 70%乙醇中-20℃的條件下保存一周,?；蛘呒?xì)胞可用配制于 PBS 中的 0.2% Triton X-100 溶液通透，室溫放置 20 min,。
（6）PBS清洗細(xì)胞兩次,。
石蠟組織切片
（1）室溫下用二甲苯浸泡石蠟組織切片2次，每次5 min,， 以*脫掉石蠟,。
【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā),，請(qǐng)?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作,。
（2）室溫下，將切片樣本浸沒于無水乙醇中漂洗2次,，每次5 min,。
（3）室溫下，將切片樣本連續(xù)浸沒在不同濃度梯度的乙醇（95%,、90%,、80%、70%）中,，每種濃度各漂洗1次,，每次5 min。
（4）室溫下,，將切片浸沒于純水中漂洗1次,，每次3 min，再將切片浸沒于1×PBS中漂洗1次,，每次3 min,，用濾紙小心吸干切片樣本周圍多余液體。
（5）用免疫組化筆在切片樣本周圍描繪樣品輪廓,，以便下游通透與標(biāo)記,。
（6）按1:100的比例， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋,， 使其終濃度為20 µg/mL,。每個(gè)樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液,， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域， 室溫孵育20 min（Proteinase K 的孵育時(shí)間,、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）,。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落,，所以要優(yōu)化孵育時(shí)間長短,。時(shí)間一般為10~30 min，4 µm左右的片子可以用10 min,，但30 µm左右的可用30 min,。過長易脫片、過短起不到通透效果,。
（7）PBS 浸潤清洗切片兩次,，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體,，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤,。
【注】：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng),。
冰凍組織切片
（1）將冰凍切片放置于室溫的片架上,，室溫20 min，晾干,。
（2）將載玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（in PBS）中,，室溫固定30 min。
（3）PBS 浸潤清洗切片兩次,，每次5 min,。
（4）用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。
（5）按1:100的比例,， 將2 mg/mL的Proteinase K溶液用1 × PBS稀釋,， 使其終濃度為20 µg/mL。每個(gè)樣本上滴加100 µL稀釋好的Proteinase K溶液,， 使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域,，室溫孵育10 min（Proteinase K 的孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化）,。
【注】：蛋白酶K可以幫助滲透組織,，但延長孵育時(shí)間可能導(dǎo)致切片脫落，所以要優(yōu)化孵育時(shí)間長短,。時(shí)間一般為10~30 min,，4 µm左右的片子可以用10 min，但30 µm左右的可用30 min,，需摸索合適時(shí)間,。過長易脫片,、過短起不到通透效果。
（6）PBS 浸潤清洗切片兩次,，每次 5 min,，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣品放在濕盒中保持濕潤
陽性處理(僅陽性對(duì)照進(jìn)行此步驟,，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟)
（1）按1:10的比例用ddH2O將10 × DNase I Buffer稀釋成1 × DNase I Buffer備用,。
（2）滴加100 µL 1 × DNase I Buffer到已通透的樣本上，室溫平衡5 min,。
（3）用1 × DNase I Buffer 以1:100稀釋DNase I (2 U/μL),，使其為終濃度20 U/mL的工作液。
（4）輕輕吸掉多余液體,，加入100 μL濃度為20 U/mL DNase I工作液,，室溫孵育10 min。
（5）輕輕吸掉多余液體,，PBS清洗樣品2次。
2. TUNEL 反應(yīng)：
（1）每個(gè)樣本加入 100 μL TUNEL 平衡緩沖液,，孵育 5 min,。
（2）預(yù)先配制 TUNEL 反應(yīng)混合液：每個(gè)樣本需要已加入1 μL TdT 酶的 50 μL TUNEL 反應(yīng)緩沖液。
（3）棄去平衡緩沖液,，用濾紙小心吸去切片樣本周圍的多余液體,，每個(gè)樣本加入 50 μL TUNEL 反應(yīng)混合液。
a.貼壁細(xì)胞,，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本,。37℃避光孵育 60 min。
b.懸浮細(xì)胞,，可加入微孔板中,，采用微孔板振蕩器進(jìn)行孵育或每隔 15 min 溫和的震蕩反應(yīng)管，使之充分反應(yīng),。37℃避光孵育 60 min,。
c.組織樣本，用蓋玻片使緩沖液均勻覆蓋樣本,。將樣本平放于濕盒內(nèi),，37℃恒溫箱孵育2小時(shí)，濕盒底部鋪一張含少量水的紙巾保持濕度,。37℃避光孵育 2 h,。
d.去掉反應(yīng)液，在1×PBS 的染色缸中浸泡潤洗2次,，每次5 min,。再使用適量配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100,，其中含 5 mg/mL BSA 的緩沖液清洗樣本3 次，每次5 min,，以降低背景,。
（5）（可選）復(fù)染：每個(gè)樣本滴加濃度為2 μg/mL 的DAPI染液，避光室溫孵育10 min,。染色完后,，輕輕去掉染液，并將樣本在1×PBS中浸泡潤洗3次,，每次5 min,。
（6）（可選）封片：將切片樣本先純水浸沒5 min，再放入70%乙醇浸沒5 min ,，再80%乙醇浸沒5 min,，90%乙醇浸沒5 min，95%乙醇浸沒5 min,，無水乙醇浸沒5 min,，后將切片樣本置于染色缸中以新鮮的二甲苯浸泡透明化處理2次，每次5 min（通風(fēng)廚中操作）,。脫水完成后,，擦去切片周圍的液體，每個(gè)切片樣本滴加50 μL抗熒光淬滅封片液,，蓋上蓋玻片,，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*,。
（7）用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察,、分析，Cy3的激發(fā)波長為550nm,，發(fā)射波長為570nm（凋亡細(xì)胞應(yīng)被標(biāo)記上明亮的紅色熒光,，沒有加入TdT 酶的陰性對(duì)照樣本未被標(biāo)記上熒光）。
注意事項(xiàng)
1.該產(chǎn)品*于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用,，不得用于臨床診斷,、治療等領(lǐng)域。
2.熒光染料均存在淬滅問題,，保存和使用過程中請(qǐng)盡量注意避光,，以減緩熒光淬滅。
3.為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。