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      螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在ATP,、鎂離子和氧氣存在的條件下,，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過程中,，會(huì)發(fā)出生物熒光(Bioluminescence),。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下,，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide,，在Coelenterazine 氧化的過程中也會(huì)發(fā)出生物熒光。生物熒光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)或液閃測(cè)定儀進(jìn)行測(cè)定,。



　　在 DLR 檢測(cè)中,，螢火蟲（Firefly）熒光素酶和海腎（Renilla）熒光素酶的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測(cè)。先是先以熒光素(Luciferin)為底物來檢測(cè)螢火蟲熒光素酶(Firefly Luciferase),，后以腸腔素(Coelenterazine)為底物來檢測(cè)海腎熒光素酶(Renilla Luciferase),，并在后續(xù)加入海腎熒光素酶底物時(shí)，同時(shí)加入抑制螢火蟲熒光素酶催化Luciferin發(fā)光的物質(zhì),，使后續(xù)檢測(cè)僅僅檢測(cè)到海腎熒光素酶的活性,，實(shí)現(xiàn)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。通過熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系,，可以非常靈敏,、高效地檢測(cè)基因的表達(dá),。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或5' 啟動(dòng)子區(qū)克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區(qū)克隆在Luciferase 的下游等,，構(gòu)建成報(bào)告基因(Reporter Gene)質(zhì)粒,，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞,，測(cè)定熒光素酶活性,。通過熒光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。 Renilla Luciferase 相對(duì)更多地被用作轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參,，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異,。
　　上海李記生物Firefly & Renilla雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒具有檢測(cè)迅速、靈敏度高,、檢測(cè)范圍廣,，無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。

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試劑盒組分

保存方法
      -80℃保存,。A,、B、D 組分在-20℃可以穩(wěn)定保存3個(gè)月,，在-80℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月,。
C和E組分在-20℃避光條件下可以穩(wěn)定保存6個(gè)月。將C組分溶解到B組分后,，該混合液在-20℃可以保存一個(gè)月,，在-80℃可以保存3個(gè)月并且該混合液不可反復(fù)凍融，建議進(jìn)行小批量分裝,。Renilla Luciferase Assay solution（D + E）應(yīng)新鮮配制,，當(dāng)天使用。

使用方法
1.細(xì)胞裂解
（1）將轉(zhuǎn)入報(bào)告基因的細(xì)胞中的培養(yǎng)基移除,，加PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細(xì)胞可直接進(jìn)行此操作,，懸浮細(xì)胞要離心收集細(xì)胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用無菌水按 4:1 稀             釋 A 組分),， 然后將培養(yǎng)板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min,，充分裂解細(xì)胞。

 注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h,，-70℃可長(zhǎng)期存放（裂解產(chǎn)物不能多次反復(fù)凍融）,。如果熒光素酶的表達(dá)水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液,，例如6孔板的每孔用量可以小為  100μL,。
（2）將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10000-15000 rpm 離心 3-5 min,。離心后將上清液移入新的 EP 管中進(jìn)行后續(xù)檢測(cè),。
（3）細(xì)胞裂解后可以立即測(cè)定熒光素酶,，也可以先凍存，待以后再測(cè)定,。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定,。
2. 工作液配制
（1）用B 組分充分溶解C 組分,，配制成0.2 mg/mL的螢火蟲熒光素酶檢測(cè)液。
  注：螢火蟲熒光素酶工作液不能反復(fù)凍融,，若單次實(shí)驗(yàn)用量較少,，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。
（2）用D組分將E組分稀釋成1× Coelenterazine工作液,，稀釋方法為將1 µL E組分加入到49 µL D組分中,，此稀釋方法可按比例相應(yīng)擴(kuò)大。
注：1× Coelenterazine工作液應(yīng)該現(xiàn)用現(xiàn)配,。
3. 化學(xué)發(fā)光值檢測(cè)
（1）將上述配制好的螢火蟲熒光素檢測(cè)液和1× Coelenterazine工作液恢復(fù)至室溫,。
（2）按儀器操作說明書開啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀，將測(cè)定間隔設(shè)為2 s,，測(cè)定時(shí)間設(shè)為10 s,。
（3）每個(gè)樣品測(cè)定時(shí)，取樣品20-100μL(如果樣品量足夠,，請(qǐng)加入100μL,；如果樣品量不足可以適當(dāng)減少用量，但同批樣品的使用量宜保持一致),。
（4）加入100μL螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑,，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定RLU(relative light unit)。以報(bào)告基因細(xì)胞裂解液為空白對(duì)照,。
  注：由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光,，建議加入螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑后，立即進(jìn)行發(fā)光值的檢測(cè),。
（5）在完成上述測(cè)定螢火蟲熒光素酶步驟后,，加入 100 μL海腎熒光素酶檢測(cè)工作液，用槍打勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測(cè)定RLU(relative light unit),。
（6）在以海腎熒光素酶為內(nèi)參的情況下,，用螢火蟲熒光素酶測(cè)定得到的 RLU 值除以海腎熒光素酶測(cè)定得到的 RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報(bào)告基因的激活程度,。如果以螢火蟲熒光素酶為內(nèi)參,，也可以進(jìn)行類似計(jì)算。

注意事項(xiàng)
1. 為取得理想測(cè)定效果,，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定時(shí),，樣品和測(cè)定試劑混合后到測(cè)定前的時(shí)間應(yīng)盡量控制一致,；使用具有化學(xué)發(fā)光測(cè)定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時(shí)，宜先把樣品全部加好,，然后統(tǒng)一加入螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑,。
2. 由于溫度對(duì)酶反應(yīng)有影響，所以測(cè)定時(shí)樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測(cè)定
3. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。