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產(chǎn)品描述

Annexin V-647/PI 細胞凋亡檢測試劑盒提供了一種快速簡便的方法,，通過標記早期凋亡細胞（遠紅）和壞死細胞（紅色），用于檢測細胞凋亡水平,。產(chǎn)品可以使用流式細胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測,。

Annexin V-647可以標記凋亡細胞。Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine,，簡稱 PS),。在細胞發(fā)生早期凋亡時，PS 會外翻到細胞表面,，即細胞膜外側(cè),。用遠紅色熒光探針647 標記的 Annexin V，即 Annexin V-647,，可以結(jié)合外翻的磷酯酰絲氨酸,，從而檢測細胞凋亡的重要特征。我們公司的647染料與普通熒光素相比,，熒光亮度更高,，且不受環(huán)境中 pH 的影響，具有良好的光穩(wěn)定性,。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料,，它可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞的細胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā),，呈現(xiàn)紅色熒光,。

訂購信息

光譜特性

Annexin V-647: Abs/Em = 650/665 nm

PI: Abs/Em = 535/617 nm (with DNA)

產(chǎn)品組分

保存方法

冰袋運輸，4℃避光保存,，保質(zhì)期12個月,。

使用方法

    下列實驗方案以利用星形孢菌素誘導(dǎo)Jurkat細胞凋亡為例,，如果使用其他誘導(dǎo)劑和其他類型的細胞，實驗條件需要略作調(diào)整,。

1.流式細胞檢測

（1）根據(jù)實驗要求誘導(dǎo)細胞凋亡,。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照,。此外,，設(shè)定一組樣品做單染，用于調(diào)節(jié)補償,。

（2）收集細胞,。懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞,；貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后300 g,，4℃離心5 min收集細胞,，胰酶消化時間不宜過長,，以防引起假陽性。

注：用胰蛋白酶消化然后使細胞在合適的細胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約30分鐘,，然后再染色,。胰蛋白酶消化會暫時破壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細胞膜的細胞質(zhì)表面上,，從而導(dǎo)致假陽性染色,。

（3）用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次,，每次均在300 g,，4℃下離心5 min，收集1-5×105個細胞并用100μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細胞,。

（4）每管加入 4-5μL的Annexin V-647和5μL的PI工作液,。

注：我們推薦準備兩管額外的流式管，每管中只加入一種單染染料（Annexin V-647和PI各一管）,，用于流式的補償調(diào)節(jié),。

（5）室溫避光孵育 10-15 min，為避免影響細胞凋亡進程,，孵育過程可在冰上操作,。

（6）每管加入400μL的PBS或1×結(jié)合緩沖液，盡快通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,。Annexin V-647可以由647 nm激光激發(fā),，檢測熒光發(fā)射光譜約在647 nm處（APC通道），PI發(fā)射光譜約在617 nm處,。

2.熒光顯微鏡檢測

    對于懸浮細胞,，可參照流式細胞檢測的方法進行具體操作。

（1）在蓋玻片或載玻片小室中接種細胞,。

（2）根據(jù)實驗要求誘導(dǎo)細胞凋亡,。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照,。

（3）用PBS 洗滌細胞,。

注：細胞收集后如果不用PBS清洗，可以用含血清的培養(yǎng)基直接替代Annexin V結(jié)合緩沖液,，但是 Annexin V的使用濃度需要重新優(yōu)化,。

（4）每 100 μL的Annexin V結(jié)合緩沖液中加入5-25μL的Annexin V-647和 5μL的PI。

注：適宜使用濃度由具體實驗要求確定,。

（5）向培養(yǎng)板中加入足量的染液以覆蓋全部細胞,，室溫避光孵育15-30 min。為避免影響細胞凋亡進程,，孵育過程可在冰上操作,，但孵育時間至少延長至30 min。

（6）用 1×結(jié)合緩沖液清洗細胞,。

（7）將孵育有細胞的蓋玻片置于載玻片上,，載玻片可提前加一滴 1×結(jié)合緩沖液；對于培養(yǎng)在小室內(nèi)的細胞,，可直接加入足量的 1×結(jié)合緩沖液覆蓋細胞,。

（8）使用合適的濾光片在熒光顯微鏡下觀察細胞。Annexin V-647可用 APC 適用的濾光片,，PI可用 Cy3或者Texas濾光片,。

注意事項

熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光,，以減緩熒光淬滅,。