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一,、支原體污染檢測

1.     支原體檢測方法概述

支原體污染嚴重干擾細胞實驗結果,，檢測有無支原體污染的方法較多，可以根據(jù)自身實驗室條件,、檢測方法便捷性等作出選擇,。

= 1 \* GB3 ①電子顯微鏡，相差顯微境觀察,。用掃描電鏡或透射電鏡,，直觀觀察支原體形態(tài)?；蛘咴诩毎囵B(yǎng)瓶內預置蓋玻片，接種細胞在蓋玻片上,，培養(yǎng)24小時后取出用油鏡觀察,。如有支原體，因支原體與細胞在不同平面,，可發(fā)現(xiàn)支原體呈現(xiàn)暗色顆粒裝,。缺點：設備要求嚴格，檢測成本高,，不適合普通實驗室日常常規(guī)檢測,。

= 3 \* GB3 ③DNA熒光染色法，利用支原體沒有細胞膜（壁）的特性,，用熒光染料Hoechst 33258染色,， Hoechst 33258能與支原體DNA結合著色，在熒光顯微鏡下觀察,，呈現(xiàn)綠色小點,。缺點：靈敏度太低，當檢測成陽性時,，細胞經(jīng)常已經(jīng)嚴重污染,。

= 4 \* GB3 ④培養(yǎng)法，用支原體培養(yǎng)基大量增殖支原體,，是相對可靠的支原體檢測技術,。缺點：耗時長，需要數(shù)周時間才能得到結果,，不適合作為細胞培養(yǎng)液中支原體污染的快速檢測,。此外,，該方法不能檢測豬鼻支原體，因為豬鼻支原體不能在固體培養(yǎng)基上形成可見的菌落,，豬鼻支原體（M.Hyorhinis）約占所有支原體污染的20-50%,。

= 5 \* GB3 ⑤PCR法，提取細胞培養(yǎng)液,，提取支原體,，制備樣品，根據(jù)支原體高度保守的16SrRNA序列設計引物（避免真核細胞或細菌DNA干擾）,，設置陰性,，陽性對照，擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳后成像觀察,，可識別已發(fā)現(xiàn)的幾乎全部100余種支原體,。

= 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速檢測法，拓撲酶環(huán)化支原體DNA,，在根據(jù)高保守區(qū)設計的引物引導下,，采用特殊等溫DNA擴增酶，61℃條件下,，連續(xù)滾環(huán)式擴增支原體DNA 60分鐘,，根據(jù)有無支原體污染，隨著擴增進程可目視實驗結果,。

= 7 \* GB3 ⑦化學發(fā)光法,，裂解支原體后，有底物情況下,，支原體特異性的酶,，能將ADP轉化成ATP。ATP參與熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的過程,，所以可以通過催化底物熒光素導致的生物發(fā)光（Bioluminescence）信號來判別支原體DNA存在與否,。

綜上所述，在多種支原體檢測方法中,，受實驗條件,、實驗時長、便捷性等因素限制,， = 1 \* GB3 ①- = 4 \* GB3 ④僅在很少情況下得到應用,。實際科研工作中，應用的是 = 5 \* GB3 ⑤ PCR支原體檢測法,； = 6 \* GB3 ⑥Quick Cell快速支原體檢測法,； = 7 \* GB3 ⑦化學發(fā)光支原體檢測法。

2.     幾種zui常用支原體檢測方法比較

3.     支原體檢測策略及方法選擇

①單個方法獨立檢測支原體（正確檢出率80%-99.9%）

就單個檢測方法及原理而言，“化學發(fā)光法”擁有zui高的正確檢出率（99.9%）,，用時zui短,，應為方法?？蛇x產(chǎn)品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065，價格：約9800元/100次）,，或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發(fā)光法檢測試劑盒（CAT:C4056L1065,，價格：1250元/50次）”。

若受實驗室條件所限沒有配備化學發(fā)光檢測儀,，或多功能酶標儀,，建議選擇“Quick Cell快速檢測法”，該方法1小時出結果,，避免了PCR法因細胞代謝產(chǎn)物抑制PCR反應導致的假陰性出現(xiàn),，正確檢出率大于99%，對設備幾乎無要求,，可目測結果,。產(chǎn)品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒（CAT:C4056L1060，價格：1250元/50次）”,。

 ②多原理支原體檢測策略

市場在售的所有支原體檢測試劑盒,，目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染，如果從事細胞治療,、進行干細胞培養(yǎng),、生產(chǎn)血清,、胰酶、培養(yǎng)液工作的科研人員,，強烈建議選擇兩種以上檢測方法,，確保支原體正確檢出率達到100%，避免關鍵實驗不必要的損失,。

細胞培養(yǎng)支原體污染是個普遍性問題,，污染來源很多，根據(jù)國外生物實驗室的規(guī)范做法,，實驗室的支原體檢測要定期進行,，一般一個月做一次支原體檢測，可以*時間確定支原體污染情況,，顯著降低或避免支原體污染對細胞培養(yǎng)相關實驗的影響,。

二、支原體污染去除

1.     支原體污染預防

根據(jù)可能的支原體污染來源,，在體外細胞培養(yǎng)過程中,，要嚴格控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作,；細胞培養(yǎng)基和實驗器材,、耗材要保證無菌；在不影響實驗結果的前提下,，可在細胞培養(yǎng)基中加入適量的特定抗生素,；發(fā)現(xiàn)支原體污染后，要清除支原體,，防微杜漸,。

2.     支原體污染的去除及預防

因為支原體沒有細胞壁，一般用于細胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用,，如青霉素,、萬古霉素多粘菌素（polymycin）、利福平,、磺胺藥物普遍沒什么效果,。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內酯類及一些氟喹諾酮,。在低濃度時,，這些抗生素不會產(chǎn)生耐藥性，且對哺乳動物細胞的毒性較小,。四環(huán)素和大環(huán)內酯能結合30S和50S核糖體亞基,，從而抑制支原體蛋白質合成，喹諾酮抑制DNA旋轉酶。因此可以在細菌DNA復制及蛋白質合成兩個層面上抑制細菌生長,，明顯增強除菌效果,。

3.      支原體去除試劑選擇

選擇支原體去除試劑需要注意幾個關鍵幾點： ①細胞毒性小，毒性大的試劑在去除支原體的同時,，會殺死細胞,；②支原體去除效果，選擇廣譜試劑,，去除多種支原體,，以及細菌，真菌等,； ③操作簡便,，沒有二次污染；要考慮操作使用是否方便,，因為如果使用起來比較麻煩,，首先是費時費力，另外可能會帶來二次污染,。目前市場上有多種支原體去除&預防試劑可選,。包括李記生物的Quick Cell支原體預防/去除試劑，美國GenDEPOT公司的Cellmaxin,，羅氏公司的BM-Cyclin,，Biolnd的BIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3，以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等,。

 Quick Cell支原體預防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體,，抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯(lián)合使用兩種成分,，分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染,，細胞毒性更小。作用周期1-2周,，支原體去除率大于92%。去除預防兼顧

BM-Cyclin包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四環(huán)素（BM-Cyclin 2）兩種成分,，抑制支原體及細菌生長,，去除培養(yǎng)細胞中已感染的支原體。適用于多種培養(yǎng)細胞,，無明顯副作用,，又不影響細胞本身的代謝，而且處理過的細胞不會重新感染支原體,。BM-Cyclin需聯(lián)合使用,，作用周期2周，可消除80%以上的支原體。不確定能否預防,。

BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素,，由真菌pleurotus mutilus 產(chǎn)生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環(huán)素,，四環(huán)素衍生物,。此兩種抗生素溶液通常按先后聯(lián)合使用2－3次循環(huán)約一周以上，可取得良好的效果,。BIOMYC-3 基于抗生素環(huán)丙沙星,，屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感,，需要根據(jù)支原體種類使用,。處理周期2周，能去除90%的支原體,。是否可以預防支原體目前還不能確定,。

Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物，包含兩個針對支原體的有效成分,，作用于蛋白質合成和DNA復制階段,，對許多細菌和真核細胞則沒有影響。作用周期2周,，去除效率未知,。有兩個濃度包裝，去除用高濃度,，預防用低濃度,。