免疫印跡法(WB),、免疫組化(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，是免疫學(xué)常用工具,，主要應(yīng)用于蛋白的定位,、定性和定量。
其中 WB實(shí)驗(yàn)是先通過進(jìn)行跑電泳后,，然后將分離好的蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上,，再利用抗原-抗體-標(biāo)記物顯色來檢測(cè)樣品，常用于定性和半定量,。
圖｜ WB實(shí)驗(yàn)流程圖
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WB實(shí)驗(yàn)常見十問
1,、細(xì)胞水平做WB,，一般多少數(shù)量細(xì)胞提的蛋白夠做WB？做組織樣品的WB的時(shí)候,怎樣處理樣品,？
答：一般5×10^6就足夠了,；特殊情況需根據(jù)自己的研究來確定。
必須進(jìn)行研磨,、勻漿,、超聲處理(注意降溫)，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好,，離心要充分(12000轉(zhuǎn)/min,，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提,，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心),。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng),，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2,、蛋白變性后可以存放多久,？
答：-80℃，若沒有反復(fù)取出凍融,，保存一兩年沒有問題,。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了),。
3,、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WB檢測(cè)嗎？
答：當(dāng)然可以,，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品,；有時(shí)如果抗體特異性高且效價(jià)高，同時(shí)使用2種一抗,，可在一張膜上檢測(cè)2種不同蛋白,。
4、上樣超載多少會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)有影響,？可以用什么方法來增加上樣量,？
答：正常超載30％不會(huì)有問題的，但不建議超載加樣,。
可以濃縮樣品,，或者根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白，還可以考慮加大膠的厚度,，以增大上樣孔體積,，比如嘗試1.5mm厚的膠。
5,、我所測(cè)定的蛋白分子量是100KD左右,，按理說分離膠應(yīng)當(dāng)采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方,，不知為何,？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因?yàn)?05KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內(nèi),，但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會(huì)發(fā)生一定地偏移,。具體參照如下圖(李記有3款預(yù)混膠、預(yù)制膠,，詳情請(qǐng)參考“關(guān)于蛋白電泳那些事")
6,、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達(dá)量有關(guān)系嗎？
答：WB一般上樣30-100μg不等,，結(jié)果跟目的蛋白的表達(dá)豐度,、上樣量、一二抗的量以及孵育時(shí)間都有關(guān)系,，也與顯色時(shí)間長短有關(guān),。
最開始摸條件時(shí)，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長一點(diǎn)(背景也容易就出來了),。要拿到好的結(jié)果,，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)測(cè)試,。
7,、想問一下細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？
答：一般來說提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,，操作時(shí)保持冰浴,，保持低溫。除非有文獻(xiàn)特別指明必須使用特殊方法,，一般來說沒有區(qū)別,。
8、轉(zhuǎn)膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶,，為什么大蛋白分子的一端的轉(zhuǎn)膜表現(xiàn)不是很好,？
答：這是正常的，大分子的蛋白轉(zhuǎn)移很慢,，你延長轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流,，大分子一端就會(huì)好的多，但是小分子的就有可能會(huì)變淡(轉(zhuǎn)過的表現(xiàn)),。注意一點(diǎn)：麗春紅染色較好,，不是你的目標(biāo)蛋白成功轉(zhuǎn)移至膜上的標(biāo)準(zhǔn),，只能作為一個(gè)粗略參考,。
9、做半定量WB,，內(nèi)參β-actin,，GAPDH哪個(gè)好？
答：一般選用β-actin就可以,，也可以使用GAPDH,，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin,。
10,、請(qǐng)問一下PVDF膜和NC膜的區(qū)別是什么？為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的,？
答：PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,，有疏水作用但相對(duì)較弱,，和蛋白接合較牢，不易脫落,，結(jié)果較好,。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的,。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復(fù)洗幾次后,，蛋白容易掉下來,，結(jié)果較差。
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活動(dòng)時(shí)間：2021.8.10-2021.8.13
活動(dòng)編號(hào)：Li210810H
活動(dòng)范圍：全國生物相關(guān)終端客戶
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