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siRNA是目前基礎(chǔ)研究中常用的基因沉默（基因干擾）形式之一,，方便快捷,，在各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用,。常規(guī)siRNA產(chǎn)品為凍干粉形式的即用型試劑,，-20°保存。進(jìn)行特異性靶點設(shè)計,，覆蓋人,、小鼠、大鼠全基因組的所有基因,，借助化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)適合進(jìn)行各種細(xì)胞RNAi實驗,。此外，通過對siRNA進(jìn)行特殊化學(xué)修飾，可以實現(xiàn)在體內(nèi)實驗更加高效,、特異,、穩(wěn)定。

siRNA轉(zhuǎn)染原理

siRNA在細(xì)胞中降解mRNA的機制與miRNA類似（如上圖）,，合成的siRNA通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞中,，隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復(fù)合物,，RISC復(fù)合物招募 AGO2,，隨后正義鏈被降解，siRNA 反義鏈與互補配對的 mRNA 序列結(jié)合,，接著 AGO2 對mRNA 進(jìn)行切割,，最終引起 mRNA 的降解。

siRNA轉(zhuǎn)染實驗步驟（下面以 24 孔板為例,，其他培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染可以咨詢李記生物）

1,、接種細(xì)胞

   對于貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞按照每孔1-2x10^5個細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板,，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-80% 為佳,。

   對于懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，用250 μL Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基 (無血清) 重懸細(xì)胞,，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板,，細(xì)胞密度為60-80%。

2,、準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物（或轉(zhuǎn)染試劑-miRNA復(fù)合物）

   (1)對于每孔細(xì)胞,，取2 μLsiRNA (20 μM，DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中,，加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑與siRNA 混合,，室溫孵育3 min。

   (2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清),，輕輕混勻,，在室溫下靜置30 min，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物,。

   (3)30 min后,，往上述復(fù)合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清)，輕輕混勻,。

3,、轉(zhuǎn)染細(xì)胞

   (1)細(xì)胞用PBS清洗1-2次，將上述350µL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物加入每孔細(xì)胞。

   (2)在 37℃,，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-48 h,，無需更換新的培養(yǎng)液，之后即可檢測基因干擾效果或者后續(xù)功能實驗,。注：可在轉(zhuǎn)染12h后補充500 μL培養(yǎng)基,。

siRNA轉(zhuǎn)染效率驗證

siRNA沉默效果分析siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，siRNA 在  細(xì)胞內(nèi)一系列酶的作用下形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物,，識別并切割靶基因mRNA,，誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)， 從而抑制了細(xì)胞內(nèi)目的基因蛋白的表達(dá),，一般可從兩個方面進(jìn)行檢測,。

 • mRNA 水平 - QPCR檢測

  siRNA的作用機理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明,。一般在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時后即可檢測到靶mRNA水平的降低,，可采用細(xì)胞總RNA提取，全長cDNA合成,，熒光定量實驗即可檢測到mRNA 的敲除效率,。

 • 蛋白水平 - WB檢測

  siRNA引起靶基因mRNA的降解，從而影響了靶蛋白的表達(dá),。但蛋白水平檢測時間受細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量,、穩(wěn)定性、半衰期,、甚至其他調(diào)控等因素的影響,，蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關(guān)系。一般在轉(zhuǎn)染后48后開始WB檢測,，72,，96 小時，甚至更長時間之后多點采樣,。