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ROS也叫活性氧（reactive oxygen species）是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一種具有氧化活性的化學(xué)物質(zhì)，包括過氧化氫,、超氧陰離子等,。ROS在正常生理?xiàng)l件下也會產(chǎn)生，但當(dāng)其產(chǎn)生過多或清除不足時,，會對細(xì)胞造成氧化應(yīng)激,，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和疾病發(fā)生。

檢測原理

用于檢測細(xì)胞內(nèi)ROS廣泛采用的方法是DCFH-DA熒光探針法。DCFH-DA（二氯熒光黃雙乙酸鹽）是一種可指示的探針,，其本身不具有熒光,，但可以自由穿過細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞,，它會被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH,。由于DCFH無法穿過細(xì)胞膜，因此熒光探針會在細(xì)胞內(nèi)積聚,。細(xì)胞內(nèi)的ROS能夠氧化無熒光的DCFH,，生成有熒光的DCF，且熒光強(qiáng)度與ROS水平成正比,。通過熒光顯微鏡,、流式細(xì)胞儀或激光共聚焦顯微鏡等設(shè)備，在最大激發(fā)波長480nm和最大發(fā)射波長525nm下檢測熒光

檢測步驟

一,、裝載探針

刺激時間較短（通常為2 h以內(nèi)）的細(xì)胞：先裝載探針,，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。

刺激時間較長（通常為6 h以上）的細(xì)胞：先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,，后裝載探針,。

1、原位裝載探針（僅適用于貼壁細(xì)胞）

2,、收集細(xì)胞后裝載探針（適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞）

二、檢測

原位裝載探針法：激光共聚焦顯微鏡直接觀察,，或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì),、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測。

收集細(xì)胞后裝載探針：用熒光分光光度計(jì),、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測,，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

注意事項(xiàng)

① 探針裝載后,，一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針,，否則會導(dǎo)致背景較高。

② 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后,，可以進(jìn)行激發(fā)波長的掃描和發(fā)射波長的掃描,，以確認(rèn)探針的裝載情況是否

良好。

③ 盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外）,，以減少各種可能的誤差,。

④ 根據(jù)結(jié)果顯示的整體熒光強(qiáng)度的高低，可以適當(dāng)調(diào)整DCFH-DA探針的稀釋倍數(shù)以及孵育時間,。