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　　高保真DNA聚合酶是一種具有高準(zhǔn)確性和高速度的酶,，廣泛應(yīng)用于PCR擴增,、突變篩選、基因克隆,、DNA測序等領(lǐng)域,。其在基因工程和生物技術(shù)研究中有著十分重要的作用。

　　作用原理：高保真DNA聚合酶可將DNA單鏈合成DNA雙鏈,，并對DNA進行擴增。該酶的作用機理基于DNA聚合酶基本的催化反應(yīng)機制：利用DNA單鏈為模板,，在DNA聚合酶的作用下,，引物與模板互補結(jié)合進行DNA聚合反應(yīng)。高保真DNA聚合酶的主要特點是：具有一定的3’-5’外切活性,，能修正因PCR擴增引入的多種誤差,，如插入、缺失,、錯配等,；具有高度準(zhǔn)確性，錯誤率極低（10-7-10-10）,；能長時間持續(xù)擴增反應(yīng),，具有良好的穩(wěn)定性,。

　　操作方法：高保真DNA聚合酶的操作方法大致分為PCR擴增、突變篩選和基因克隆等步驟,。

　　1,、PCR擴增：將模板DNA、引物,、dNTP,、緩沖液、高保真DNA聚合酶等反應(yīng)組分混合,，進行不斷循環(huán)變溫PCR擴增反應(yīng),，即可擴增出目標(biāo)DNA。在反應(yīng)過程中,，應(yīng)避免DNA聚合酶與其他反應(yīng)組分的污染,，控制反應(yīng)溫度和時間，并根據(jù)反應(yīng)結(jié)果進行后續(xù)實驗操作,。

　　2,、突變篩選：高保真DNA聚合酶可利用其3’-5’外切活性修正Ab拷貝酶的不配對，使其通過突變篩選后得到正確的組合,，從而從大量試驗基質(zhì)中快速篩選出突變體,。突變篩選方法一般是利用比較高效的突變誘導(dǎo)劑處理，通過后續(xù)的PCR擴增驗證篩選得到的突變體,。

　　3,、基因克隆：基因克隆常常需要構(gòu)建帶有一定限制性內(nèi)切酶切位點的載體,，因此在擴增目標(biāo)DNA的同時要進行相關(guān)的酶切和連接操作,。具體步驟為：首先將DNA金黃色葡萄球菌酶進行擴增，然后進行限制性內(nèi)切酶切割,，再利用DNA連接酶將其連接到載體上,，最后在大腸桿菌等細菌中進行轉(zhuǎn)化和篩選。