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細(xì)胞凍存和復(fù)蘇經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

2016/11/29　　閱讀(53)

    細(xì)胞凍存過(guò)程對(duì)保持細(xì)胞狀態(tài)影響巨大,，李記生物結(jié)合多年實(shí)踐,，總結(jié)出如下實(shí)用的細(xì)胞凍存流程。 “慢凍快融” 是細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則,，這對(duì)zui大限度的保存細(xì)胞活力至關(guān)重要,。目前細(xì)胞凍存多用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作為保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇時(shí),，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生是關(guān)鍵。緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的物理?yè)p傷。復(fù)蘇細(xì)胞采用快速融化的方法可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)融化,，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷,。

細(xì)胞凍存操作流程：

1、細(xì)胞凍存前12~24h,，換新鮮培養(yǎng)基,，使細(xì)胞一直處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2,、待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合時(shí)胰酶消化,，用新鮮培養(yǎng)基吹打后制成細(xì)胞懸液，1000rpm離心10min,。懸浮細(xì)胞則直接離心,。

3、棄上清,，加入凍存液重懸細(xì)胞沉淀,，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107cells/mL。將細(xì)胞懸液分至凍存管內(nèi),，每管1~1.5mL,，擰緊蓋子,。在管壁上做好標(biāo)記，標(biāo)明細(xì)胞名稱,、凍存日期等,。（細(xì)胞凍存液配方可為胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=4：6：1或胎牛血清：培養(yǎng)基：DMSO=1：9：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件調(diào)整）

4,、按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min →-20℃ 30min →-80℃放一晚→液氮保存,。也可使用程序降溫盒更為方便，細(xì)胞凍存管放入程序降溫盒內(nèi)可直接放入-80℃放一晚,，再轉(zhuǎn)至液氮罐內(nèi),。注意程序降溫盒內(nèi)異丙醇的量必須高于zui低刻度線；凍存5次后異丙醇需要跟換一次,，以免影響凍存效果,。

5、細(xì)胞凍存后應(yīng)取出一管復(fù)蘇,，檢測(cè)細(xì)胞的存活率,。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存，為穩(wěn)妥起見(jiàn)可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng),，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,，再繼續(xù)凍存。

細(xì)胞復(fù)蘇操作流程：

1,、將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預(yù)熱,；準(zhǔn)備一個(gè)15mL無(wú)菌的離心管，加入8mL預(yù)熱培養(yǎng)基,。

2,、將凍存細(xì)胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復(fù)溫（可準(zhǔn)備一潔凈的燒杯,，裝滿37℃的水,，細(xì)胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）,。輕輕晃動(dòng)凍存管,，使細(xì)胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細(xì)胞能盡快通過(guò)zui易受損的溫度段（-5~0℃）,。注意凍存管管口不能沒(méi)入水中,，避免引起污染。

3,、用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺(tái)內(nèi),，將管內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至準(zhǔn)備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細(xì)胞均勻分散,，降低DMSO濃度,，吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次,，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi),。

4,、800rpm離心5min,，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基,，吹打制成細(xì)胞懸液,。

5、將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi),，補(bǔ)加適量的培養(yǎng)基,，輕輕晃動(dòng)細(xì)胞瓶使細(xì)胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。

6,、第二天觀察細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細(xì)胞,。繼續(xù)培養(yǎng),，待細(xì)胞長(zhǎng)至80~90%匯合時(shí)正常傳代。一般剛復(fù)蘇的細(xì)胞需經(jīng)過(guò)2~3次傳代,，細(xì)胞活力恢復(fù)后才能進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),。

對(duì)DMSO不敏感的細(xì)胞在復(fù)蘇時(shí)也可不離心，減少操作步驟,，也可降低污染的幾率,。將解凍的細(xì)胞懸液直接轉(zhuǎn)移至T25細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基,，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng),。但培養(yǎng)12~20h后必須換新鮮的培養(yǎng)基，移除死細(xì)胞,。