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Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒

產品描述

《Quick Cell發(fā)光法支原體檢測試劑盒》通過檢測支原體的特異性酶活性以達到檢測體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的,。在支原體裂解后,，該支原體特異性的酶，在底物存在下,，具有將ADP轉化成ATP的功能,。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產生光的反應需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產生的ATP含量,，可以通過該反應轉化成生物發(fā)光（Bioluminescence）信號,，該信號可以使用專門的發(fā)光檢測儀（Luminometer）或具有發(fā)光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發(fā)光的強度與ATP的含量成正比,。通過比較細胞培養(yǎng)上清和未用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液上清二者的支原體特異性酶的含量,，即可知道培養(yǎng)的細胞是否被支原體污染,。反應原理如下：

使用方法

1、檢測試劑的準備

產品從-80 ℃冰箱取出,，在冰上操作,，*次使用，分別用2.5 mL支原體檢測溶液溶解試劑A和試劑B, 按每管50 μL可分別分裝到50個1.5 mL離心管中,，根據待檢測的樣品數量及陰性對照數量確定A,B試劑的用量（不用的試劑放置于-80 ℃冰箱低溫保存,，隨用隨取）,。試劑A和試劑B,，放室溫5分鐘左右（注意：不能加熱），等其熔解后放冰上待用,。

? 注意：試劑A和試劑B只能在每次檢測之前從-80 ℃冰箱取出的,，熔解后在室溫放置的時間盡可能的短，不能超過20分鐘,。熔解后,，放冰上的時間也不能超2小時。已經融化后的試劑A和試劑B不能再次凍存使用,。

2、陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照,。陰性對照除了沒有培養(yǎng)細胞外其他成分*相同,，包括其中的血清批次、含量,，抗生素等含量也必須*相同,。陰性對照配制完后放于4℃冰箱。

3,、待測樣品的準備

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染,，。具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：

（1）貼壁細胞待測的細胞培養(yǎng)3天且匯合度在70-90%左右時,，取180 μL培養(yǎng)液上清上,，在普通臺式離心機上200 g (大約1500 rpm )低速離心5 分鐘，準確吸取離心后的上清120 μL到一個新的1.5 mL離心管內,，丟棄含細胞沉淀的原有離心管,。

懸浮培養(yǎng)的細胞需要在換液傳代后，至少讓細胞生長3天再取培養(yǎng)液進行檢測,。

注意：離心力要嚴格控制在200 g左右,，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會,。更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來,，從而導致假陰性。而更低的離心力將可能導致哺乳動物細胞不能被離心沉淀下來，從而導致支原體經測時,，哺乳動物細胞內的ATP也被釋放到溶液中,，從而導致假陽性。

（2）將含有120 μL上清的1.5 mL離心管,，在臺式離心機上16000 g (大約13000 rpm)高速離心3 分鐘,，棄去上清（約108 μL）注意：切勿讓吸頭碰到離心管底部，底部為可能含有支原體的沉淀,。往離心管內,，加入108 μ*期配好的陰性對照培養(yǎng)液，并上下吹吸10次,，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻,。該樣品用于后續(xù)的支原體檢測。

注意：將培養(yǎng)液替換成陰性對照的培養(yǎng)液是為了排除一些細胞代謝產物對后續(xù)檢測的可能干擾,。

5,、將熔解后的試劑A、試劑B,、陰性對照和待測樣品放在室溫10分鐘左右（注意：不能加熱）,，以便其溫度與室溫相同，本試劑盒的*反應溫度為18-30℃,，必須確保室溫不低于15℃,。

注意：制備好的待測樣品如果不是當天立即檢測，放于-80℃冰箱保存,，不得放于室溫,、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣品在-80℃可以保存一年左右,；為了日后檢測方便,，應該同時凍存一些作為陰性對照的培養(yǎng)液。

6,、吸取50 μL陰性對照和待測樣品,，分別放入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板內，加入50 μL試劑A,，室溫反應15分鐘,。

7、加入50 μL試劑B,，室溫反應3分鐘后,，在多功能酶標儀或者發(fā)光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的參數進行發(fā)光值的檢測,，5分鐘內,，連續(xù)測5次陰性對照和待測樣品的發(fā)光值,，計算各自的平均值。

8,、結果判斷

計算待測樣品的發(fā)光平均值與陰性對照的發(fā)光平均值的比值：

 ①如果比值>1.2,，說明待測樣品有支原體污染（陽性）。嚴重的污染該比值可以達到10以上,。

 ②如果比值在1.1-1.2之間,，說明待測樣品可疑有支原體污染（可疑陽性）。該樣品需要繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后,，重新檢測,。如果繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后，重新檢測的比值仍然在1.1-1.2之間,，應該判為陰性,。

 ③如果比值<1.1，說明待測樣品無支原體污染（陰性）,。

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