產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格(元) |
Collagenase, TypeI 膠原酶I型 | C5100L0040 | 100mg | 4℃避光 | 350 |
消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶以及透明質(zhì)酸酶,，透明質(zhì)酸酶多數(shù)情況下與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用,；胰蛋白酶作用較強，容易造成平滑肌細胞損壞,；膠原酶作用較緩和,，能消化細胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細胞，對細胞損傷小,，是*一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶,。
膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌（Clostridium histolyticum）提取的一種酶粗提物,，也叫梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A）,，不僅含有膠原酶，還含有其他的一些蛋白酶,、多糖酶,、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,，多糖和脂質(zhì),。該酶分離效果好,，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,，既操作簡便又可提高細胞成活率，zui終濃度200u/mL,，此酶消化作用緩和,，無需機械振蕩。
目前商業(yè)化提供的細菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異,，分為四種類型：膠原酶I型,，II型，III型和IV型,，在應(yīng)用上有所偏向：1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶,、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶,、胰蛋白酶活性）,。通常用作上皮細胞、肝,、肺,、脂肪和腎上腺組織細胞的制備；2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性,，通常用于心臟,、骨、肌肉,、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備,；3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細胞的制備,；4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性,，通常用于胰島細胞的制備，或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗,。
使用方法
1. 膠原酶儲存液的配制
向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+,、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+,、Mg2+）,，輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液,。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過濾除菌,，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。
使用前于冰上解凍,，避免反復(fù)凍融,。其用于組織和細胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml,，需要根據(jù)特定的實驗條件或者參考相應(yīng)的文獻資料確定所需的*工作濃度,。
2．組織的分離
1）使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；
2）利用含Ca2+,、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次,；
3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS,，使其浸沒組織塊,，并加入膠原酶至需要工作濃度；
4）于37℃孵育4-18h,。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補充消化可以提高消化效率,。
5） 已分散開的細胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用,。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育,；
6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次；
7）細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞,，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度,。
8）于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞。
3． 器官灌注
1）向37℃預(yù)熱的含Ca2+,、Mg2+的HBSS中加入膠原酶,，另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率；
2）按照已優(yōu)化的速率對相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液,；
3）將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩,，從而將已解離的細胞或小片段組織塊與較大團塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進一步孵育,；
4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細胞數(shù)次,；
5）細胞培養(yǎng)液重懸上述細胞，利用自動細胞計數(shù)器或其他方法計算活細胞密度,。
6）于細胞培養(yǎng)皿上利用合適細胞培養(yǎng)基接種細胞,。
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