產(chǎn)品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | 保存 | 價格(元) |
Super SYBR Green qPCR Master Mix | D1101L1144 | 1 mL | -20℃ | 1050 |
Super SYBR Green qPCR Master Mix是一款用于實時定量PCR的即用型試劑盒,。其中Super SYBR Green是一種新型的專門為qPCR和高分辨率溶解曲線分析設(shè)計的DNA結(jié)合染料，它通過一種“按需求釋放”的機制,，極大地降低了對PCR擴增抑制性,。包含一種化學(xué)修飾的熱啟動Taq DNA多聚酶。這種Taq酶2分鐘內(nèi)可以被*激活,，尤其適用于快速PCR反應(yīng),。此外，這種Taq DNA多聚酶在室溫下沒有活性,，不會對DNA造成污染,，性能遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于市面上抗體修飾的熱啟動酶。Super SYBR Green的另一個優(yōu)點是它的安全性,。常規(guī)的DNA結(jié)合染料存在潛在的致突變性,?；谶@方面考慮，我們研發(fā)設(shè)計了Super SYBR Green染料,，它不能透過細(xì)胞膜,，因而不能與活細(xì)胞的基因組DNA結(jié)合,，確保了其安全性,。然而，其他所有的商業(yè)性PCR熒光染料都可以在幾分鐘內(nèi)進入細(xì)胞,，例如SYBR Green I,，是一種環(huán)境毒性接近溴化乙錠（EB）的誘變劑。
此外,，Super SYBR Green qPCR Master Mix還有一個非常突出的優(yōu)點,，即它的PCR產(chǎn)物可以直接用于凝膠電泳檢測，不需要額外添加任何核酸染料,。試劑盒中的Super SYBR Green可以作為DNA預(yù)染的核酸染料,，電泳后可以直接用于觀察DNA條帶。光譜特性：Ex/Em: 500/528nm,，常規(guī)的凝膠成像系統(tǒng),，不需要做任何調(diào)整。
試劑盒組成
組分 | D1101L1144 | D1101L1145 |
A（2×master mix） | 1.0 mL | 5×1 mL |
B（10×ROX reference dye） | 0.5 mL | 5×0.5 mL |
使用方法
1.實驗參考因素
1）如果使用玻璃毛細(xì)管進行反應(yīng)（Roche LightCycler用戶部分實驗用到）,，那么需要在反應(yīng)體系中額外加入BSA（終濃度 ～0.5 mg/mL）,；如果使用透明的塑料毛細(xì)管，則不需要添加BSA,。
2）溶解曲線分析儀器：Rotor-Gene 6000, ABI 7500 ,HR1™, 384-well LightScanner™, Roche LightCycler 480,Rotor-Gene 6000, ABI 7500 和Roche LightCycler480等儀器都可以用于qPCR和溶解曲線的分析,。具體參照儀器生產(chǎn)商的使用說明進行數(shù)據(jù)的采集和分析操作。
3）ΔR 和 ΔRN：當(dāng)比較眾多qPCR Master Mix產(chǎn)生的熒光信號強度時,，需要注意比較的方法,。通常ΔR是高于基線水平的熒光增量。一般來說,，10 μL 的 1× Super SYBR Green反應(yīng)體系與50 μL ABI公司的1×PowerSYBR 或Invitrogen公司的1×SYBR Green I相比,，可以產(chǎn)生更高的ΔR。ΔRN定義為ΔR除以ROX值,。因此高濃度的ROX可以產(chǎn)生更低的ΔRN,。當(dāng)ROX被ABI 7500, iCycler IQ, MJ opticon, MJChromo4, MX3000或MX4000儀器zui大激發(fā)時，ΔRN會更小,。因此,，應(yīng)用于商業(yè)SYBR Green Master Mix的較低濃度的ROX往往會產(chǎn)生更高的ΔRN。
4）預(yù)期的動力學(xué)曲線：根據(jù)對比實驗我們發(fā)現(xiàn),， Super SYBR Green Master Mix的PCR擴增曲線與SYBR Green I的MasterMix相比,，其靈敏度和穩(wěn)定性更高,。由于SYBR 染料對DNA擴增的抑制性影響，基于SYBR染料的Master Mix在PCR達到Ct閾值后通常會延遲擴增5-7個循環(huán)數(shù),。相比較而言,，SuperSYBR Green Master Mix可以使PCR持續(xù)擴增至50個循環(huán)。
5）Ct值：在相同條件下,，使用Super SYBR Green和SYBR Green I進行的qPCR反應(yīng),，其Ct值相對誤差在+1或-1之間。
6）擴增片段長度：為了使SYBR Green qPCR Master Mix的擴增效率達到*,，推薦的DNA擴增長度為50-200 bp,，如果需要擴增更長的DNA片段，那么需要適當(dāng)延長PCR的反應(yīng)時間,。
7）凝膠電泳分析PCR擴增產(chǎn)物：當(dāng)使用Super SYBR Green MasterMix進行PCR擴增反應(yīng)后,，如需進行DNA凝膠電泳分析，只要在PCR反應(yīng)溶液中加入DNA loading buffer,，按常規(guī)程序上樣,，跑電泳，不需要在制膠時額外添加核酸染料,。使用254 nm UV激發(fā)器,、凝膠成像儀，或SYBR Green濾光器可以直接觀察凝膠,。另外,，凝膠也可以用488nm 的激光凝膠掃描儀進行觀察。
2.PCR反應(yīng)體系
每管反應(yīng)組分如下表所示(供參考)
反應(yīng)組分 | 反應(yīng)量（20 μL） | 終濃度 |
2× SYBR Green qPCR Master Mix | 10 μL | 1× |
引物 | × μL | 0.1-0.5 μM |
模板 | × μL（見注1 & 2） | 見注3 |
ROX | 適量 | 見注4 & 表1 |
H2O | 補足至20 μL |
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注：1）cDNA模板：SYBR Green qPCR Master Mix適用于mRNA的定量分析,。*步通過逆轉(zhuǎn)錄將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA,，第二步利用Super SYBR Green kit進行cDNA的定量擴增。為了確保擴增效率,，cDNA樣品的體積不要超過總反應(yīng)體積的10%,。為了定量轉(zhuǎn)錄水平，我們推薦使用no-RT的對照樣品,，以排除可能的基因組DNA的污染,。
注：2）一步法RT-qPCR用于mRNA的定量分析。首先引物設(shè)計時要盡量避免形成引物二聚體,。我們建議合理優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄酶的使用量和逆轉(zhuǎn)錄過程的持續(xù)時間,。耐熱的逆轉(zhuǎn)錄酶可以兼容Agilent, Fermentas, Lucigen和Life Technologies等各種儀器。如果可以,，設(shè)計的引物Tm值盡量在55℃左右,，逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)擴增反應(yīng)也應(yīng)在55℃。為了定量轉(zhuǎn)錄水平,，我們推薦使用no-RT的對照樣品,，以排除有可能的基因組DNA的污染,。
注：3）模板濃度：DNA模板依照不同需求，其反應(yīng)量也有所不同,。推薦的基因組DNA的模板量范圍是50 pg-50 ng,，推薦的cDNA 的模板量范圍是50fg-50pg。
注：4）參照染料ROX：對于某些固定型號的儀器,，必須添加ROX才能測定Ct值,。ROX的使用濃度可以參照表1（見第4頁）。ROX會給熔解曲線分析造成一定的背景干擾,。因此,，為了避免ROX雜峰干擾,，在應(yīng)用軟件的“Passive Reference Dye”中不要選擇檢測ROX熒光值選項,，然后再進行數(shù)據(jù)的收集與分析。
3.反應(yīng)程序設(shè)置
您可以根據(jù)擴增模板的性質(zhì)和儀器的功能,，選擇以下三個程序之一進行實驗,。
A．兩步快速擴增法
這個程序適用于大多數(shù)引物Tm為60℃的擴增，溶解曲線遵循您所用儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行,。
程序 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
酶激活 | 95℃ | 2 min | 1 |
變性 退火&延伸 | 95℃ 60℃ | 5 s（見注5） 30 s | 45 |
注：5）變性時間：如果擴增片段較短,，變性時間可以低于5 s，甚至可以低至0 s,。當(dāng)變性時間設(shè)置為“0”時,，它僅僅意味著溫度增加到96℃，然后沒有停留迅速降溫,。設(shè)置時間5 s可以確保DNA較長片段和高GC片段的變性,。高性能的儀器會進一步增加擴增子變性的可靠性。
B . 三步擴增法
這個程序適用于擴增溫度比退火溫度高的實驗,。例如,，如果擴增片段有相對較長的引物，容易產(chǎn)生非特異性的擴增,，在更高的溫度下進行延伸可以降低非特異性擴增,。溶解曲線遵循您所用儀器提供的標(biāo)準(zhǔn)流程執(zhí)行。
程序 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
酶激活 | 95℃ | 2 min | 1 |
變性 退火 退火&延伸 | 95℃ 50-60℃ 72℃ | 5 s 5 s （見注6） 25 s（見注7） | 45 |
注：6）退火溫度：退火溫度應(yīng)根據(jù)引物Tm值設(shè)定,，通常是50 -60℃為佳,。不過，引物Tm值（和擴增溫度）應(yīng)該設(shè)計盡可能地接近60℃（但仍在50 - 60℃范圍內(nèi)）,，減少退火和變性溫度之間的差距,。這樣溫度增加所需時間更少，進而擴增效率更高,。
注：7）擴增溫度：擴增溫度設(shè)定在72℃對于大多數(shù)擴增子通常效率更高,。然而對于富含AT的擴增片段（> 70%）或含有AT富集補丁的擴增子,，60℃延長通常可以獲得更好的結(jié)果,。
C．通用程序
此程序適用于幾乎所有qPCR儀器,，也適用于使用快速擴增法無法達到較好效果的擴增子。
程序 | 溫度 | 時間 | 循環(huán) |
酶激活 | 95℃ | 5 min | 1 |
變性 退火&延伸 | 95℃ 60℃ | 15 s 60 s | 45 |
表1,、根據(jù)PCR儀種類不同,，推薦ROX使用濃度
PCR 儀 | 推薦的ROX 使用濃度 | 使用量（20 μL） |
BioRad: iCycler, MyiQ, MiQ 2, iQ 5, CFX-96, CFX-384, MJ: Op con, Op on2, Chromo4, MiniOp con Qiagen: Rotor-Gene Q, Rotor-Gene3000, Rotor-Gene 6000 Eppendorf: Mastercycler realplex Illumina: Eco RealTime PCR System Cepheid: SmartCyler Roche: LightCycler 480, LightCycler 2.0 | No ROX | None |
ABI: 7500, 7500 , ViiA 7 Stratagene:MX4000P, MX3000P, MX3005P | Low ROX 0.05-0.1×（終濃度） | 按1:10 比例稀釋 10×ROX；添加1-2 μL 1×ROX 至zui終反應(yīng)體系 |
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT , StepOne, StepOne plus | High ROX 1×（終濃度） | 2 μL 10×ROX 至zui終反應(yīng)體系 |
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