液相色譜儀保留時(shí)間不重現(xiàn)有兩種不同的情況：既保留時(shí)間漂移和保留時(shí)間波動(dòng),。前者是指保留時(shí)間僅沿單方向發(fā)生變化,，而后者指保留時(shí)間無固定規(guī)律的波動(dòng)。將此兩種情況區(qū)分開來對(duì)找到問題的原因往往很有幫助,。如,，保留時(shí)間的漂移往往由柱老化引起；而柱老化不可能引起保留時(shí)間的無規(guī)律波動(dòng),。事實(shí)上,，保留時(shí)間漂移的多半原因是不同機(jī)理的色譜柱老化，如固定相流失（例如通過水解）,，色譜柱污染（由樣品或流動(dòng)相所致）等,。保留時(shí)間漂移的幾種常見的原因如下：

　　一 色譜柱平衡

　　如果我們觀察到保留時(shí)間漂移，首先應(yīng)考慮色譜柱是否已用流動(dòng)相*平衡,。通常平衡需要10-20個(gè)柱體積的流動(dòng)相,，但如果在流動(dòng)相中加入少量添加劑（如離子對(duì)試劑）則需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間來平衡色譜柱。

　　流動(dòng)相污染也可能是原因之一,。溶于流動(dòng)相中的少量污染物可能慢慢富集到色譜柱上,，從而造成保留時(shí)間的漂移。應(yīng)注意：水是很容易污染的流動(dòng)相成分,。

　　二 固定相穩(wěn)定性

　　固定相的穩(wěn)定性都是有限的,，即使在推薦的PH范圍內(nèi)使用，固定相也會(huì)慢慢水解,。例如,，硅膠基質(zhì)在pH4時(shí)水解穩(wěn)定性更好。水解速度與流動(dòng)相類型和配體有關(guān),。雙官能團(tuán)配體和三官能團(tuán)配體比單官能團(tuán)配體的鍵合相要穩(wěn)定,；長(zhǎng)鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩(wěn)定；烷基鍵合相比氰基鍵合相穩(wěn)定的多,。

　　經(jīng)常清洗色譜柱亦會(huì)加速色譜柱固定相的水解,。其他硅膠基質(zhì)鍵合相在水溶液環(huán)境中也可以發(fā)生水解,，如氨基鍵合相等。

　　三 色譜柱污染

　　保留時(shí)間漂移的另一個(gè)常見原因是色譜柱污染,。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器,，它可以過濾并吸附流動(dòng)相攜帶的任何物質(zhì)。污染源可以是：流動(dòng)相本身,，流動(dòng)相容器,，連接管、泵,、進(jìn)樣器和儀器密封墊,，以及樣品等。通常通過實(shí)驗(yàn)可判斷污染的來源,。

　　樣品中如果存在色譜柱上保留很強(qiáng)的組分,，就可能是使保留時(shí)間漂移的潛在根源。這些根源通常是樣品基質(zhì),。如：配藥中的賦形劑,，生化樣品（如血清）中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的淀粉,，環(huán)境水樣中的腐殖酸等,。通常樣品中的強(qiáng)保留組分具有較高的分子量，在此情況下,，保留時(shí)間漂移的同時(shí)或其后會(huì)有反壓的增加,。可以通過使用固相提?。⊿PE）等樣品前處理方法來去除樣品基質(zhì)的影響,。

　　避免色譜柱污染簡(jiǎn)單的方法是防患于未然。相比之下,，找到問題的所在并設(shè)計(jì)有效的清洗步驟以去除污染物要困難的多,。通常使用在給定色譜條件下的強(qiáng)溶劑，但并非所有污染物都可以在流動(dòng)相中溶解,。如THF可去除反相色譜柱中的許多污染物,，但蛋白在THF中就不能溶解。DMSO常常用于去除反相色譜柱中的蛋白,。

　　使用保護(hù)柱是個(gè)非常有效的方法,。反沖色譜柱僅是不得已時(shí)采用的辦法。

　　四 流動(dòng)相組成

　　流動(dòng)相組成的緩慢變化也是保留時(shí)間漂移的常見原因,。如流動(dòng)相中易揮發(fā)組分的揮發(fā)及循環(huán)使用流動(dòng)相等,。

　　五 疏水坍塌

　　當(dāng)小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的水為流動(dòng)相時(shí),，有時(shí)會(huì)發(fā)生分離突然喪失及被分析物質(zhì)保留明顯降低或*不保留的現(xiàn)象,，這就是疏水坍塌,。此現(xiàn)象是由流動(dòng)相不浸潤(rùn)固定相表面而致。挽救的辦法實(shí)現(xiàn)用含大量有機(jī)組分的流動(dòng)相浸潤(rùn)固定相,，再用高水含量的流動(dòng)相進(jìn)行平衡,。色譜柱長(zhǎng)期儲(chǔ)存也會(huì)發(fā)生此現(xiàn)象。使用內(nèi)嵌極性基團(tuán)的反相色譜柱（如Waters  SymmetryShield RP色譜柱）或非端基封口的色譜柱（如Waters  Resolve色譜柱）也可避免發(fā)生坍塌,。

　?。ㄒ唬┍Ａ魰r(shí)間變化    ①柱溫變化--柱恒溫    ②等度與梯度間未能充分平衡--至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱    ③緩沖液容量不夠--用>25mmol/L的緩沖液    ④柱污染--每天沖洗柱    ⑤柱內(nèi)條件變化--穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相    ⑥柱快達(dá)到壽命--采用保護(hù)柱

　　（二）保留時(shí)間縮短

　?、倭魉僭黾?-檢查泵,重新設(shè)定流速

　?、跇悠烦d--降低樣品量

　　③鍵合相流失--流動(dòng)相PH值保持在3~7.5;檢查柱的方向

　?、芰鲃?dòng)相組成變化--防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀

　　⑤溫度增加--柱恒溫

　?。ㄈ?保留時(shí)間延長(zhǎng)

　?、倭魉傧陆?-管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡

　　②硅膠柱上活性點(diǎn)變化--用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱

　?、坻I合相流失-- 同前（二）3

　?、芰鲃?dòng)相組成變化--同前（二）4

　　⑤溫度降低--同前（二）5