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RNA提取原理
RNA提取時,，加lv仿后分三層：水相(含rna,可能還有少量DNA）,，中間白色薄層（應(yīng)該是蛋白和DNA）,，下層有機相（lv仿和蛋白等）
lv仿是分子量比較大的有機溶劑,，在提取RNA時,，lv仿可以有效的使有機相和無機相迅速分離。DNA提取過程 有機相中主要是酚和蛋白結(jié)合,，從而使得蛋白和DNA脫離,，DNA進入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離,，否則DNA會釋放到水相,。不管有酚也好，沒有酚也好,，lv仿本身也對蛋白有變性作用,，劇烈的震蕩，很容易使得DNA的親水基團,，與水相接觸,。所以不要劇烈震蕩。
yi丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團受到保護,，等同于沉淀,，但是這是個反應(yīng)時發(fā)生在水相中，與前面的lv仿不矛盾。
lv仿的作用有多個方面,，一是作為有機溶劑變性蛋白,，使其沉淀并通過離心除去，同時也通過變性作用抑制RNase活性,；二是RNA提取試劑中通常含有ben酚（Trizol主要成分就是ben酚,，很多自己配試劑提的方法也用ben酚，抽提蛋白時也會用到ben酚）,，ben酚微溶于水,，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會損傷核酸,，需要通過lv仿把水相里參與的ben酚抽提掉,；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等）,，起到一定除雜作用,。
因為細胞中存在DNA酶，在提取之前細胞破碎的時候沒有加DNA酶抑制劑,，DNA已經(jīng)被分解了,。上層水相，PH 5.1左右,，當溶液pH在酸性的時候,，DNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相,。而當pH接近中性時,，DNA就會溶解在水相，（導致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對,，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過量）
TRIzol Reagent 提取total RNA步驟：
1. 查下表根據(jù)樣品量選擇適當?shù)?TRIzol Reagent體積裝入50ml RNase-free離心管中,，注意樣品體積不能超過TRIzol Reagent體積的10%。
組織量 | TRIzol Reagent | lv仿 | yi丙醇 | 75%乙醇 |
50~100mg | 1ml | 0.2ml | 1ml | 1ml |
2.將組織樣品放入TRIzol Reagent中,，高速下勻漿15-30秒/次,，直至看不見組織和細胞碎片。
3.室溫溫育10分鐘,。
4. 據(jù)表2加入適量體積的lv仿,，劇烈震蕩15秒鐘，然后室溫下溫育3分鐘,。
5. 4ºC,，12000g離心15分鐘，形成淡紅色的ben酚/lv仿有機相,，中間相和上層水相,，水相約占TRIzol體積的60%,。
6. 轉(zhuǎn)移上清于另一個Rnase-free的 50ml離心管中。根據(jù)表2加入適量yi丙醇,，-20ºC沉淀1小時以上,。
7. 4ºC，12000g離心10分鐘,。
8. 去上清,，據(jù)表2加入適量體積的75%的乙醇混勻。
9. 4ºC,，7500g離心5分鐘,。
10．去上清，空氣中干燥或真空抽干RNA沉淀,，但不要太干,。加入適量體積的DEPC-WATER，溶解沉淀,。
11．取少量RNA用于測定其OD值和電泳，其余置-80ºC冰箱中保存,
