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輕松看懂pcr實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
辛辛苦苦提完 RNA，逆轉(zhuǎn)錄后一個(gè)個(gè)孔加完引物和模板,，Z后進(jìn)行 RT-PCR,，你以為這樣就可以美滋滋地坐等結(jié)果了,？等到一幅下面這樣的結(jié)果圖,，不知道對(duì)于剛接觸 RT-PCR 的你來說內(nèi)心是否是崩潰的？
這是啥,？怎么看,？
別急,，讓我慢慢跟你介紹,，看完后你就能準(zhǔn)確的分析出你的 RT-PCR 結(jié)果了,。「這里以 7500 軟件為例進(jìn)行介紹」
1. 首先設(shè)置好內(nèi)參和對(duì)照組「在 Analysis Settings 處」,，一般我們?cè)谏蠙C(jī)前會(huì)對(duì)應(yīng)設(shè)置好的,，如果設(shè)置好的話可以直接跳至第 3 點(diǎn)。如果沒有設(shè)置好的話是需要重新進(jìn)行設(shè)置,。
2. 點(diǎn)擊進(jìn)去后,，選擇對(duì)應(yīng)好的內(nèi)參和對(duì)照組,。「在 Relative Quantization Settings 選項(xiàng)下」
3.選擇好內(nèi)參和對(duì)照組后,，我們首先看看 PCR 跑的有沒有問題,，在這里大家Z常會(huì)見到的問題是在樣品池出現(xiàn)了三角形符號(hào)，如下圖：
那么這些三角形代表什么意思,？沒錯(cuò),，聰明的你應(yīng)該已經(jīng)想到是這個(gè)孔出現(xiàn)了問題，而三角形中的數(shù)字是幾則代表了孔中有幾個(gè)問題,。具體又是什么問題呢？我們就要通過 analysis 中的 QC Summery 進(jìn)行查找,。
舉個(gè)栗子,，比如圖中的 A9 孔，出現(xiàn)了 2,，則表示有 2 個(gè)問題，第 1 個(gè)問題如上圖所示,，High standard deviation 高的標(biāo)準(zhǔn)偏差,，表示可能是你上樣時(shí)導(dǎo)致的樣品復(fù)孔之間差異較大。第二個(gè)問題則是下圖中,，系統(tǒng)認(rèn)定 A9 孔中的數(shù)值偏差較大,，屬于異常值。
當(dāng)然,，還有比較常見的問題是引物二聚體引起的雙重峰，如 A4 孔,。
4. 溶解曲線「melt curve」：表示隨溫度升高 DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線,。總的 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)降解一半的溫度稱為熔解溫度「Tm」,，不同序列的 DNA,，Tm 值不同。DNA 中 G-C 含量越高,，Tm 值越高,，成正比關(guān)系。正如上面提到的,，正常的樣品孔溶解曲線應(yīng)該是單峰的，如下圖,。如果出現(xiàn)了雙峰,，則要考慮是否引物設(shè)計(jì)不合理或者引物過量引起溶解曲線出現(xiàn)多峰的情況。
5. 如果前面的幾項(xiàng)都沒有太大的問題的話,。Z后我們看看Z重要的結(jié)果,，也就是目的基因的變化情況了。在內(nèi)參與對(duì)照組選擇沒錯(cuò)的情況下,，點(diǎn)擊 gene expression 選項(xiàng),，選中你想查看的樣品孔的基因表達(dá)情況。
好了,，這次的 RT-PCR 看圖分析就到這里,。Z后需要注意的是圖中的結(jié)果還需要輸出進(jìn)行后續(xù)的自行運(yùn)算得出結(jié)果。圖中的結(jié)果只能給出參考,。但大致趨勢(shì)是相同的,，如果還有童鞋想聽后續(xù)如何計(jì)算 RT-PCR 的結(jié)果及原理的話，歡迎關(guān)注下期的 RT-PCR 結(jié)果的計(jì)算原理與計(jì)算模板,。