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細胞培養(yǎng)的基礎版知識（供參考）
基礎篇-無菌操作基本技術
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,，以70% ethanol擦拭無菌操作抬面,，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后,，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株,，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,，將實驗物品帶出工作臺,，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10分鐘以上后,，再進行下一個細胞株之操作,。
2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品,，例如試管架,、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出,，以利于氣流之流通,。實驗用品以70% ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺內,。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作,。
3. 小心取用無菌之實驗物品,，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,，亦不要在打開之容器正上方操作實驗,。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身,，傾斜約45°角取用,，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全,，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗,。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少Class II）,。操作過程中,，應避免引起aerosol之產生，小心毒性藥品,，例如DMSO及TPA等,，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目：
5.1. CO2鋼瓶之CO2壓力,。
5.2. CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度,、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水,，每周更換)。
5.3. 無菌操作臺內之airflow壓力,，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜,，預濾網(300小時/預濾網，3000小時/HEPA),。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750）,，定期更換水槽的水。
基礎篇-實驗用品
1. 種類：
1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌,，除了玻璃容器與pasteur pipet外,，其它均為塑料無菌制品,。
1.2. TC級培養(yǎng)盤表面均有coating高分子物質以讓細胞吸附,，培養(yǎng)容器種類有Tflask,，plates, dishes, roller bottle等，依實驗需要使用,。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料離心管：15 ml, 50 ml,，均有2 種不同材質,，其中polypropylene (PP)為不透明材質,，polystyrene (PS)為透明材質,，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml,，250ml,，500ml,，1000ml,。
2. 清洗：
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時,，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶,，以高壓蒸汽滅菌,，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗,。
3. 滅菌：
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘,，置于oven中烘干,。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸,，即漂白水) 或是蒸汽高壓滅菌121 ℃, 15 lb, 20 分鐘處理,。
基礎篇-培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃ 冰箱，避免光照,，實驗進行前放在37℃ 水槽中溫熱,。
2. 液體培養(yǎng)基（加血清）存放期為六個月,，期間glutamine可能會分解,，若細胞生長不佳,，可以再添加適量glutamine,。
3. 粉末培養(yǎng)基配制(以1 升為例)：
3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10%血清,，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900 ml，pH為7.2-7.4,。NaHCO3 為另外添加,，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH之誤差,，或局部過堿,。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應分別溶解后才混合,，然后用CO2氣體調整pH，而非用強酸(HCl)或強堿(NaOH),，因為氯離子對細胞生長可能有影響,，且貯存時培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。
3.2. 材料：
純水（milli-Q水或二次至三次蒸餾水,，水品質非常重要）,，粉末培養(yǎng)基，NaHCO3,，電磁攪拌器,，無菌血清瓶，0.1或0.2 mm無菌過濾膜,，pH計,，真空泵，CO2氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700 ml milli-Q水中,，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中,，攪拌使其溶解,，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合,?；旌笕芤褐畃H應為7.2-7.4，除非pH值偏差太大,，否則不需用酸堿再調整之,。若為太堿，可再通入CO2氣體調整pH,。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時,，pH會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,，同時分裝至無菌容器中,，標示培養(yǎng)基種類、日期,、瓶號等,，貯存于4℃。(血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾)
3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試,。
附-配制培養(yǎng)基之生長測試
材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
步驟：
1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,，接種MDCK 細胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每個well 接種1 × 102 活細胞,，同時作對照組實驗,。
2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長,，待細胞群落大到可以肉眼觀察,，而群落間不互相接觸時即可。
3. 去除培養(yǎng)基,，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦ 3:1),，室溫下靜置10 min。
4. 去除固定液,，水洗二次,。
5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，,，室溫下靜置染色2-3 min,。
6. 去除染液，水洗二次,。
7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù),，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳,，則丟棄之,。
基礎篇-抗生素
1. 細胞庫之細胞培養(yǎng)基不加抗生素
1.1. 培養(yǎng)自ATCC 引進之細胞株,，培養(yǎng)基中不加抗生素。
1.2. 培養(yǎng)自其它實驗室引進之細胞株,，制作token freeze前培養(yǎng)基須添加抗生素,，待token freeze通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不加抗生素,。
2. 寄送活細胞時,，須將培養(yǎng)液充滿整個flask時，則須添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml),。
3. 若要檢測mycoplasma,，則培養(yǎng)基內不可添加gentamicin，因gentamicin會抑制mycoplasma生長,。
4. 去除細菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml,，注意混合使用后藥物毒性會增強。
5. 抗生素使用種類與濃度：
工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
基礎篇-血清
1. 血清必須貯存于–20～–70℃,，若存放于4℃,，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶,，可將40～45ml 分裝于無菌50ml離心管中,，由于血清結凍時體積會增加約10 %， 必須預留此膨脹體積之空間,，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形,。
2. 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾,。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物,，則可將血清加入培養(yǎng)基內一起過濾，勿直接過濾血清,。
3. 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天,，至室溫下全溶后再分裝，一般以50ml無菌離心管可分裝40～45 ml,。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡),，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生,。勿直接由–20℃直接至37℃解凍,，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發(fā)生沈淀,。
4. heat-inactivation 是指56℃, 30 分鐘加熱已*解凍之血清,。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化,。除非必須,，一般不建議作此熱處理,，因為會造成沉淀物之顯著增多，且會影響血清之品質,。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿將血清置于37℃太久,，若在37℃放置太久,，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定之成份亦會因此受到破壞,，而影響血清之品質,。
6. 血清之沉淀物
6.1. 凝絮物：發(fā)生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成,，這些凝絮沉淀物不會影響血清本身之品質,。若欲減少這些凝絮沉淀物，可用離心3000rpm, 5min去除,，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾,。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜,。
6.2. 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經過熱處理之血清,，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是“小黑點”,，常會誤認為血清遭受污染,，而將血清放在37℃中欲培養(yǎng)此“微生物“，但在37℃環(huán)境下,，又會使此沉淀物增多,，更會誤認為微生物之增殖，但以培養(yǎng)細菌之培養(yǎng)基檢測,，又沒有污染,。一般而言，此小黑點應不會影響細胞之生長,，但若懷疑此血清之品質,，應立即停用，更換另一批號的血清,。
附-血清之生長測試
材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
6-well TC plate (or 35mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
步驟：
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已測試過) 培養(yǎng)MDCK 細胞于T75 flask 至80% confluency,。
2. 以trypsin-EDTA 處理細胞，離心后,，加入適量不加血清之a-MEM 制成細胞懸浮液,，并測細胞濃度。以不加血清之a-MEM 稀釋細胞濃度為1×102活細胞數(shù)/ ml,。
3. 將1 ml 細胞懸浮液接種入6-well plate 中,，并另加入1 ml 含不同濃度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM,，使血清終濃度為10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已測試過之血清同時進行對照組試驗,。
4. 37 oC,，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7 天，期間不需更換培養(yǎng)基,，待細胞群落大到可以肉眼觀察,，而群落間不互相接觸即可。
5. 去除培養(yǎng)基,，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦ 3:1),，室溫下靜置10 min。
6. 去除固定液,，水洗二次,。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，,，室溫下靜置染色2-3 min,。
8. 去除染液，水洗二次,。
9. 以肉眼計數(shù)群落數(shù)
10. 計算SPE ( Serum Plating Efficiency )：
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 計算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比較各濃度血清培養(yǎng)基之RPE,，即可得知待測血清對細胞生長的影響。訂購多量同一批號的優(yōu)良血清,，置于–70℃保存之
基礎篇-細胞傳代培養(yǎng)
1. 細胞生長至高密度時,，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為1:3 至1:6,，依細胞種類而異,。
2. 材料：
2.1. 無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：
以10ml 分裝于15ml無菌離心管中，保存于–20℃,，使用前放在37℃水槽回溫,。
2.3. 新鮮培養(yǎng)基
2.4. 無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶
3. 步驟：
3.1. 附著型細胞（adherent cell）
3.1.1. 吸掉舊培養(yǎng)液。
3.1.2. 用D-PBS洗滌細胞一至二次,。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2),，37℃作用數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察,，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時,，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA,，則在trypsin-EDTA作用后,，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用，離心后再吸掉上清液)。
3.1.4. 輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落,，加入適量之新鮮培養(yǎng)基,，以吸管上下吸放數(shù)次以打散細胞團塊，混和均勻后,，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中,，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.2. 懸浮型細胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出細胞培養(yǎng)液,，放入離心管中,，離心1000 rpm 5 分鐘。
3.2.2. 吸掉上清液,，加入適量之新鮮培養(yǎng)基，混和均勻后,，依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中,，以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培養(yǎng)三天以上才會產生抗體,，若是更換培養(yǎng)基,，則可能會失去抗體。因此繼代培養(yǎng)不需離心后更換培養(yǎng)基,，直接添加新鮮培養(yǎng)基稀釋細胞濃度即可,。若體積太大，可傾斜放置,，或分殖至新培養(yǎng)瓶中,。
基礎篇-細胞冷凍保存
1. 注意事項：
1.1. 欲冷凍保存之細胞應在生長良好（log phase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度,。
1.2. 冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質,，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
1.3. 注意冷凍保護劑之品質,。DMSO應為試劑級等級,，無菌且無色(以0.22micronFGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650),，以5~10 ml小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。Glycerol 亦應為試劑級等級,，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用,，因長期儲存后對細胞會有毒性,。
1.4. 冷凍保存之細胞濃度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3*106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，細胞濃度不要太高,，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后si去,。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,，依細胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml,。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106cells/ml。
1.5. 冷凍保護劑濃度為5或10％ DMSO,，若是不確定細胞之冷凍條件,，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture,，以防止冷凍失敗,。
1.6. 冷凍方法：
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4℃ 10分鐘---> -20℃ 30分鐘---> -80℃ 16-18小時(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長期儲存。
1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1～–3℃/分鐘之速度由室溫降至–120℃,，放在液氮槽vapor phase長期儲存,。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
2. 材料：
2.1. 生長良好之培養(yǎng)細胞
2.2. 新鮮培養(yǎng)基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球計數(shù)盤與蓋玻片
2.7. 等速降溫機(KRYO 10 Series II)
3. 步驟：
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,，觀察細胞生長情形,。
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，后濃度為5-10％,，混合均勻,，置于室溫下待用。
3.3. 依細胞繼代培養(yǎng)之操作,，收集培養(yǎng)之細胞,，取少量細胞懸浮液((約0.1 ml)計數(shù)細胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心,，去除上清液,，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,，混合均勻,，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1 ml/vial,，并取少量細胞懸浮液作污染檢測,。
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30分鐘→ -80℃ 16～18小時(或隔夜)→液氮槽vapor phase長期儲存。
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中,，再放入液氮槽中,。程序為: program 7: HB CELL
基礎篇-冷凍細胞活化
1. 冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害,，導致細胞之死亡,。
2. 細胞活化后，約需數(shù)日，或繼代一至二代,，其細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質),。
3. 材料：
37℃ 恒溫水，新鮮培養(yǎng)基,，無菌吸管/ 離心管/ 培養(yǎng)瓶,，液氮或干冰容器
4. 步驟：
4.1 操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷凍管,，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程,，此時蓋子易松掉,。
4.3 將新鮮培養(yǎng)基置于37 C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,，移入無菌操作臺內,。
4.4 取出冷凍管，立即放入37 C 水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70% ethanol 擦拭保存管外部,，移入無菌操作臺內,。
4.5 取出0.9 ml解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(稀釋比例1:10～1:15),，混合均勻,，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。另取0.1 ml 解凍細胞懸浮液作存活測試,。
4.6 解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol),，依細胞種類而異，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護劑,。若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10 ml 培養(yǎng)基之離心管內,，離心1,000 rpm, 5 分鐘,，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻,，放入CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
4.7 若不需立即去除冷凍保存劑,，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基,。
基礎篇-收到細胞的處理方式 (一)
1. 收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即通知,。細胞株請盡速開始培養(yǎng),，或立即冷凍保存(置于–70 C，隔夜后,，移到液氮),。
2. 冷凍細胞解凍程序:
2.1. 依據(jù)細胞株數(shù)據(jù)單之基礎培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例,，制備培養(yǎng)基,。絕大多數(shù)之細胞均無法立即適應不同之基礎培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因實驗需要,，必須有所不同時,，務必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細胞適應后,，方進行所需之實驗,。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大,，請務必依據(jù)細胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之,。
2.3. 將培養(yǎng)基置于37 C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之,，移入無菌操作臺內,。取出冷凍管，立即放入37 C水槽中快速解凍,，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿,，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化后,，以70% ethanol 擦拭冷凍管外部,，移入無菌操作臺內。
2.4. 依據(jù)細胞種類和濃度,，于無菌操作臺內取10ml培養(yǎng)基加至T25或T75 flask中,。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25或T75 flask內之培養(yǎng)基,，混合均勻,，放入37 C，5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),。
2.5. 對絕大多數(shù)細胞而言,，1%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響,，不需立刻由解凍細胞中去除,， 待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可,。惟對極少數(shù)因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者,， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養(yǎng)基中,，離心300 xg (約1000 rpm)，5分鐘,，小心移去上清液,，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細胞均勻混合后,，轉移至培養(yǎng)瓶中,， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng),。
基礎篇-收到細胞的處理方式 (二)
收到T25 flask 細胞時,， 處理方式為︰
1. 于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡,，T25 flask 均加滿培養(yǎng)基,。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現(xiàn)象,，若有任何問題,， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室,。
2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C,， 5 % CO2 培養(yǎng)箱中，使細胞回溫至37 °C,， 并讓運送過程中少數(shù)脫落的細胞可再附著生長,。隔天后,，于無菌操作箱內取出flask內之培養(yǎng)基,，(取出之培養(yǎng)基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養(yǎng)基于flask 內,，依一般培養(yǎng)方式再將細胞置入培養(yǎng)箱中,，或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養(yǎng),。
附-細胞計數(shù)與存活測試
1. 原理：
1.1. 計算細胞數(shù)目可用血球計數(shù)盤或是Coulter counter粒子計數(shù)器自動計數(shù),。
1.2. 血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1 mm2 大正方形,，其中4個角落之正方形再細刻16個小格,，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后,，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml,。使用時,，計數(shù)每個大正方形內之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù),，再乘以104,，即為每ml 中之細胞數(shù)目。
1.3. 存活測試之步驟為dye exclusion,，利用染料會滲入死細胞中而呈色,，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色,。一般使用藍色之trypan blue染料,，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish,。
2. 材料：
0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球計數(shù)盤及蓋玻片(Hemocytometer and coverslip),，計數(shù)器(counter)，低倍倒立顯微鏡
粒子計數(shù)器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步驟：
3.1. 取50ml細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中,。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數(shù)盤chamber 上方凹槽加入,，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察,，活細胞不染色,，死細胞則為藍色(或紅色- Erythrosinbluish)。
3.3. 計數(shù)四個大方格之細胞總數(shù),，再除4,，乘以稀釋倍數(shù)(至少乘以2，因與trypan blue等體積混合),，后乘以104,，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數(shù)。若細胞位于線上,，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞),。
4 大格*細胞總數(shù)x 2 x 104 / 4= 細胞數(shù)/ml
*每一大格的體積= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球計數(shù)盤，可用Coulter counter作自動計數(shù),，惟無法辨別死細胞或活細胞,。
3.5. 范例：
T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1 ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中,，取少許混合液加入血球計數(shù)盤,，計數(shù)四大方格內之細胞數(shù)目。
活細胞數(shù)/方格：55, 62, 49, 59
死細胞數(shù)/方格：5, 3, 4, 6
細胞總數(shù)= 243
平均細胞數(shù)/方格= 60.75
稀釋倍數(shù)= 2
細胞數(shù)/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細胞數(shù)/flask：1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %