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本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。由于酶的催化效率很高,，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度,。 ELISA可用于測(cè)定抗原,，也可用于測(cè)定抗體。

然而,，影響ELISA試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，故加強(qiáng)各個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點(diǎn),。

ELISA試劑盒的操作方法

雙抗體夾心法

1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml,。在每個(gè)板的反應(yīng)孔中加0.1ml,，4℃ 過(guò)夜。次日,，棄去孔內(nèi)溶液,，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘,。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌,，下同)。

2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,，置37℃ 孵育1小時(shí),。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔,，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔),。

3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml,。37℃ 孵育0.5~1小時(shí),，洗滌。

4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,，37℃ 10~30分鐘,。

5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺,，依據(jù)所呈顏色的深淺,，以"+"、"-"號(hào)表示,。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處,，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值,，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性,。

間接法

1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,，每孔加0.1ml，4℃過(guò)夜;

2.次日洗滌3次;

3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌;

4.(同時(shí)做空白,、陰性及陽(yáng)性孔對(duì)照)于反應(yīng)孔中,，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml;

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌;

6.'后一遍用DDW洗滌。

其余步驟同"雙抗體夾心法"的4,、5,、6。

ELISA試劑盒試驗(yàn)的注意事項(xiàng)

1,、要保證移液槍的準(zhǔn)確性,，誤差不能超過(guò)2%?？捎盟碗娮犹炱竭M(jìn)行確定,。但需要有專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行矯正。
2,、要配備20ul,、50ul、100ul,、1000ul和排槍各一支,。吸取不同的液體后，要更換槍頭,。即使是吸取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),。
3、要在實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將試劑盒從冰箱中取出,，使各種試劑都恢復(fù)到室溫,，以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4,、實(shí)驗(yàn)時(shí),，要使底物避光保存。
5,、用槍吸取液體時(shí)速度不能太快,，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準(zhǔn)確。
6,、吸取液體時(shí),，要用量程和需要量接近的槍去吸，減少誤差,。
7,、將液體加到酶標(biāo)孔中時(shí)，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸,，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,，液滴會(huì)自然流下去。
8,、液體全部加完后,，可將酶標(biāo)板在桌子上平行輕輕晃動(dòng)30秒,，混勻液體。也可以用酶標(biāo)儀的晃動(dòng)功能,。
9,、溫浴時(shí)，要用不干膠或膠帶紙封好酶標(biāo)板,，防止水分的蒸發(fā)。
10,、洗板時(shí),，每次洗液加入后，應(yīng)靜置1分鐘,，使清洗更加*,。沒(méi)有洗板機(jī)時(shí)，倒去液體后,，要將酶標(biāo)板在報(bào)紙或毛紙上用力拍干,。
11、洗液不夠時(shí),，可用蒸餾水自行配制PH7.4,，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液,。加入1/1000的疊氮鈉后可長(zhǎng)期保存,。
12、底物是光敏感的,，要在臨用前現(xiàn)配,。
13、檢測(cè)前,，要打開(kāi)酶標(biāo)儀,，使之穩(wěn)定10分鐘以上。
14,、底物有一定的毒性,，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸,。
15,、待檢樣品要澄清，否則會(huì)影響結(jié)果,。
16,、溫浴時(shí)間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。
17,、應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn),，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,。
18、對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證,。