蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)保姆級教程 Part 2:解決WB的疑難雜癥

時間：2024/8/9閱讀：343

?背景有黑點,，怎么辦,？?詳情信息

1、封閉液未溶完-全-
解決：
A.確認(rèn)BSA/牛奶有完-全溶解,，建議增加溶解時間或溶解后取上清液使用,。
B.利用0.45um濾紙過濾溶液，也可使用商品化試劑,，如GTX30964（Trident Universal Protein Blocking Reagent,，適用于WB、IHC,、ICC/IF,、ELISA）。

C.改變緩沖液,，如換為BSA,。

2、溶液污染
解決：

使用現(xiàn)配的溶液（Running/transfer/blocking/wash buffers）或商業(yè)化溶液減少因長菌長霉造成的黑點,。

3,、封閉液及抗體交互作用

解決：
一般脫脂牛奶中含有casein這種磷酸蛋白，可能會與磷酸化抗體產(chǎn)生非特異性結(jié)合,。因此,，如使用磷酸化抗體，建議用BSA作為封閉溶液,，同時洗脫溶液也用TBST,，如此可降低黑點高背景的情況,。

?過曝，怎么辦,？?詳情信息
1,、蛋白樣品過量
解決：

降低蛋白上樣量，通常蛋白上樣量為30-50ug,，但有些蛋白表達(dá)量較高（如β-actin）,，此時可依蛋白表達(dá)量，進(jìn)行微調(diào),。

2,、抗體過量
解決：
A.增加抗體稀釋倍數(shù)。
B.減少孵育時間,，一般孵育時間為37℃,，1小時。

C.于4℃過夜孵育,，減少抗體非特異性結(jié)合。

3,、訊號過曝
解決：
A.縮短曝光時間,。
B.使用低靈敏的ECL。

?拖帶,，怎么辦,？?詳情信息
1、樣品不純,，有雜質(zhì)污染
解決：
A.重新離心樣品,，取上清液使用。
B.使用較純的試劑配制細(xì)胞裂解液或購買商業(yè)化產(chǎn)品,。
C.使用Benzonase®核酸酶,，Benzonase®核酸酶能迅速水解核酸，降低蛋白樣品粘度,，減少核酸對跑膠的干擾,。

D.全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取，使用商業(yè)化全細(xì)胞或亞細(xì)胞萃取試劑盒提取蛋白樣品,，減少配制試劑溶液以及操作中分離不干凈的問題,。

2、蛋白樣品過量
解決：
A.降低蛋白上樣量,，通常蛋白上樣量為30-50ug,，但有些蛋白表達(dá)量較高(如beta actin)，此時可依蛋白表達(dá)量,，進(jìn)行微調(diào),。

B.蛋白變性不完-全，也會使條帶成團(tuán)拖曳；此時,，可通過延長樣品加熱時間(一般約5分鐘)及調(diào)整SDS(一般是2 %)比例,，使蛋白變性更完-全。

3,、訊號過曝
解決：
A.縮短曝光時間,。
B.使用低靈敏的ECL。

?條帶扭曲,，怎么辦,？?詳情信息
1、膠沒配好
解決：
A.確保APS＆TEMED正常,，并新鮮配制膠體,。

B.空的泳道加Sample Buffer

2、電流電壓問題
解決：

避免膠體過熱,。電壓過高也會出現(xiàn)微笑,、歪斜條帶等條帶，建議上層濃縮膠使用80V,；下層分離膠使用100-120V,。另外也需檢查電泳槽是否有銹蝕造成電流不穩(wěn)。過熱時可改為在冷室或者冰浴中進(jìn)行電泳,。

3,、轉(zhuǎn)膜問題
解決：
小心滾壓膠體并確保與膜貼合，有時出現(xiàn) 2個條帶是因為轉(zhuǎn)膜時不小心移動到膜產(chǎn)生疊影,。

?高背景,，怎么辦？?詳情信息
1,、封閉問題
解決：
A.確認(rèn)封閉完-全,。封閉作用不足，這是其中一種可能的原因,，提高封閉物濃度可確保封閉液完-全覆蓋轉(zhuǎn)印膜,，如使用5% 脫脂奶粉或BSA。
B.封閉液不與抗體反應(yīng),。這種情況較常發(fā)生在磷酸化抗體的使用過程中,，由于牛奶含有casein這種磷酸蛋白，因此如果使用牛奶當(dāng)封閉液,，封閉液與磷酸化抗體可能會產(chǎn)生非特異性的結(jié)合,。這個情況下，建議使用BSA作為封閉液,，同時搭配使用TBST的洗脫液來幫助降低高背景值的狀況,。

C.封閉時間增加,，一般情況會使用室溫37度封閉1小時，可視情況調(diào)整封閉的條件,。

2,、膜的問題
解決：
A.選擇合適的膜（可參考詳情信息）
B.膜干掉，建議整個實驗過程都須注意讓膜保持濕潤,，特別是PVDF膜,。

C.膜沒有完-全均勻濕透，PVDF膜較會出現(xiàn)這個狀況,，使用PVDF膜前,，需用100% methanol完-全浸潤膜。

3,、抗體問題
解決：
A.降低抗體濃度
B.以陽性對照確認(rèn)二抗

C.足夠的洗脫時間和次數(shù)

4,、呈色問題
解決：
ECL呈色問題造成高背景值的原因，可能是因為化學(xué)顯色底物過多,；建議按說明書加入適量的顯色底物,。

?非特異性條帶，怎么辦,？?詳情信息
1,、蛋白降解
解決：
A.加蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，避免蛋白降解,。
B.冰上操作。

C.避免反復(fù)凍融樣品（建議分裝）,；建議使用新鮮制備的樣品,。

2、蛋白形成多聚體

解決：
A.使用現(xiàn)配的DTT/2-ME并將加熱時間延長,，幫助打斷多聚體的雙硫鍵,。

B.樣本煮沸溫度達(dá)到95℃-100℃。

3,、確認(rèn)蛋白特性
解決：

查詢生物信息是否有后修飾,、剪切體等。

4,、抗體濃度過高/蛋白樣品過量
解決：
A.增加抗體稀釋倍數(shù),，也可調(diào)整孵育時間，并在4℃孵育,。

B.減少上樣量,。

5、抗體非特異性結(jié)合
解決：
A.增加洗膜次數(shù)與時間或在洗滌液里改用不同強度的detergent或是增加濃度,。

B.設(shè)對照組來確認(rèn)抗體非專一性結(jié)合可能的原因,，例如：是否有目標(biāo)蛋白表達(dá),。

6、抗體檢測到heavy/light chain的信號
解決：
這種情況通常發(fā)生在IP實驗里,，GeneTex有一系列可避免辨認(rèn)heavy/light chain的特制二抗,，其設(shè)計原理是用來辨認(rèn)native的一抗結(jié)構(gòu)。（可參考詳情信息）

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