CUTANA™ ChIC / CUT&RUN Kit 快速入門

Kit v4 - Manual v4.0

掃描查看完整手冊(cè)

第一天

第一部分：CUT&RUN緩沖液的制備（約30分鐘）

1. 按下表所述配制緩沖液。

注意：應(yīng)根據(jù)完整手冊(cè)附錄1.1中的說(shuō)明,，根據(jù)細(xì)胞類型優(yōu)化Digitonin（洋地黃皂苷） 的用量,。

注意：以下流程皆按單個(gè)樣本計(jì)算,，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際樣本數(shù)量等比例配制

。

第二部分：ConA磁珠活化（約30分鐘）

2. 輕輕重懸ConA磁珠,，取11 µL至1.5 mL離心管中,。

3. 將離心管放在磁力架上，使溶液澄清,；用移液器去除上清液,。

4. 從磁力架上取下離心管。立即加入100 μL冷的Bead Activation Buffer,，并用移液器將磁珠充分重懸。將離心管放回磁力架,，使溶液澄清,，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次,。

5. 加入11 µL冷的Bead Activation Buffer重懸磁珠,。

6. 按照10 µL/管的量，將磁珠等分到8聯(lián)排管中,；置于冰上,。

第三部分：細(xì)胞與活化磁珠結(jié)合（約30分鐘）

7. 計(jì)數(shù)起始細(xì)胞并確認(rèn)其完整性和活力。每樣本使用500,000個(gè)細(xì)胞（可多加10%）,。

8. 室溫下以600×g的轉(zhuǎn)速離心3分鐘,，用移液器去除上清液。

9. 用100 µL的Wash Buffer重懸細(xì)胞,。室溫下以600×g的轉(zhuǎn)速離心3分鐘,，用移液器去除上清液；此步驟重復(fù)一次,。

10. 用105 µL的Wash Buffer重懸細(xì)胞,。對(duì)制備好的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并檢查其完整性。

11. 將 100 µL 細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有10 µL 活化 ConA 磁珠的8聯(lián)排管中,。輕輕渦旋重懸,，短暫快速離心，將磁珠收集到管底部,。

12. 室溫孵育10分鐘,，使細(xì)胞吸附到磁珠上。

13. 如果使用多通道移液器,，請(qǐng)將試劑槽置于冰上,，注入冷的Antibody Buffer。注意：一次取出并更換一條8聯(lián)排管的緩沖液,，以避免 ConA 磁珠變干和樣品丟失,。

14. 將離心管放在磁力架上,，使溶液澄清，用移液器去除上清液,。保存10 µL上清液用于臺(tái)盼藍(lán)染色,，以確定上清液中沒有細(xì)胞（可依據(jù)完整手冊(cè)附錄1.2）。

15. 從磁力架上取下離心管,。立即加入50µL冷的Antibody Buffer并用移液器吹吸重懸,。取 10 µL重懸樣品以確認(rèn)細(xì)胞結(jié)合到了ConA磁珠上（可依據(jù)完整手冊(cè)附錄1.2）。

第四部分：抗體結(jié)合（約30min +過(guò)夜）

16. 瞬時(shí)離心K-MetStat Panel原液并用移液器吹吸混勻（切勿渦旋）,。在指-定用于H3K4me3和IgG對(duì)照抗體的反應(yīng)中,，加入2 µL K-MetStat Panel并渦旋混勻。注意：如果使用的細(xì)胞數(shù)少于500000個(gè),，請(qǐng)按照完整手冊(cè)第16頁(yè)的說(shuō)明減少K-MetStat Panel的量,。

17. 每個(gè)樣品加入0.5 µg抗體。對(duì)于指-定的對(duì)照反應(yīng),，加入1µL IgG或H3K4me3對(duì)照抗體,。輕輕渦旋混勻。

18. 在4oC條件下,，置于旋轉(zhuǎn)混勻儀（nutator）上孵育過(guò)夜,，管蓋稍稍抬高。切勿翻轉(zhuǎn)離心管,。

第二天

第五部分：pAG-MNase結(jié)合（約40 min）

19. 將試劑槽放在冰上,，注入冷的Cell Perm. Buffer,。

20. 將離心管從4℃條件下取出,，瞬時(shí)離心收集液體。注意：磁珠過(guò)夜可能沉淀，屬正?，F(xiàn)象,。

21. 將離心管置于磁力架上，使溶液澄清,，去除上清液,。

22. 將離心管保留在磁力架上。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer,，用移液器去除上清液,；此步驟重復(fù)一次,。

23. 從磁力架上取下離心管,。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer,，輕輕渦旋混勻,。注意：磁珠在這個(gè)階段可能會(huì)結(jié)塊，可用移液器輕柔吹吸,，使結(jié)塊分散,。

24. 每管加入2.5µL pAG-MNase,。輕輕旋渦或用移液器吹吸,，以重懸磁珠并使酶均勻分布。

25. 室溫孵育10分鐘,。

26. 瞬時(shí)離心后,，置于磁力架上,，使溶液澄清,，去除上清液,。

27. 將離心管保留在磁力架上,。每管加入200µL冷的Cell Perm. Buffer，用移液器去除上清液,；此步驟重復(fù)一次,。

28. 從磁力架上取下離心管。每管加入50µL冷的Cell Perm. Buffer。用移液器輕輕吹吸混勻,、分散團(tuán)塊,。

第六部分：目標(biāo)染色質(zhì)片段化（約3小時(shí)）

29. 將離心管置于冰上。每管加入1 μL 100 mM的氯化鈣,，輕輕渦旋或用移液器吹吸均勻,。

30. 將離心管（管蓋略微抬高）放在旋轉(zhuǎn)混勻儀上4oC孵育 2 小時(shí)。

31. 制備終止液：取1µL E. coli Spike-in DNA與33µL Stop Buffer混合（單個(gè)反應(yīng)用量）,。輕輕旋渦混勻,。注意：如果使用的細(xì)胞數(shù)少于500,000個(gè)，請(qǐng)按照完整手冊(cè)附錄2中的說(shuō)明稀釋E. coli Spike-in DNA,。

32. 孵育結(jié)束后,，向每個(gè)反應(yīng)中加入34 μL終止液，輕輕旋渦混勻,。

33. 將反應(yīng)離心管置于37℃熱循環(huán)儀中,，孵育10分鐘。

34. 瞬時(shí)離心后,，置于磁力架上,，使溶液澄清。將含有DNA富集產(chǎn)物的上清液轉(zhuǎn)移到新的8聯(lián)排管中,。丟棄含有ConA磁珠的離心管,。

第七部分：DNA純化（約30分鐘）

35. 用無(wú)水乙醇（EtOH）和分子生物學(xué)級(jí)別的水制備85%乙醇（EtOH）（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

36. 重懸SPRIselect試劑（Beckman Coulter, Inc）,，向每個(gè)反應(yīng)管中緩慢加入119 µL,。

37. 輕輕旋渦混勻，瞬時(shí)離心以收集液體,。室溫孵育5分鐘,。

38. 將離心管放在磁力架上2-5分鐘。用移液器去除上清液,，不要用移液管吸頭攪動(dòng)磁珠,。

39. 將離心管保留在磁力架上。每管加入 180 µL 85% EtOH,，用移液器去除上清液,；此步驟重復(fù)一次。

40. 瞬時(shí)離心,，管蓋朝內(nèi),，使磁珠留在離心管一側(cè)。將離心管放回磁力架上,，去除殘留的EtOH,。

41. 從磁力架上取下離心管,，打開管蓋。室溫風(fēng)干磁珠2-3分鐘或直到液體蒸發(fā),，但磁珠仍然呈現(xiàn)潮濕的啞光棕色,。如果磁珠有裂紋或呈淺棕色，說(shuō)明過(guò)于干燥,。

42. 每管加入17 µL 0.1X TE buffer洗脫DNA,。

43. 渦旋重懸磁珠，室溫孵育2分鐘,。

44. 將離心管置于磁力架上2分鐘,。將15µL CUT&RUN DNA轉(zhuǎn)移到新的8聯(lián)排管中。

45. 使用Qubit熒光儀對(duì)1 μL DNA進(jìn)行濃度測(cè)定,。繼續(xù)文庫(kù)制備或?qū)NA保存在-20oC,。

關(guān)于預(yù)期結(jié)果，可參閱完整手冊(cè),。切勿使用TapeStation/Bioanalyzer檢測(cè) CUT&RUN DNA,。DNA的產(chǎn)量太低，無(wú)法在這些平臺(tái)上進(jìn)行檢測(cè),，而且在實(shí)驗(yàn)步驟的這一步也無(wú)法提供有用的信息,。可等到文庫(kù)制備后再檢查片段分布,。

EpiCypher的注冊(cè)商標(biāo)和知識(shí)產(chǎn)權(quán)可見鏈接：咨詢代理商欣博盛生物

本文中的所有其他商標(biāo)和商品均為其各自公司所有,。

本文系翻譯，如與原文有出入的地方,，請(qǐng)以英文原文為準(zhǔn),。

未經(jīng)EpiCypher公司事先書面同意，本文件不得部分或全部復(fù)制,。

關(guān)于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學(xué)公司,。從專有組蛋白肽陣列平臺(tái)EpiGold™開始，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品,。同時(shí),，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)-導(dǎo)-者,。利用其獨(dú)-有技術(shù),，不斷增加產(chǎn)品庫(kù)中高純度修飾重組核小體（dNucs™）產(chǎn)品。dNuc™多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強(qiáng)大的工具,。

EpiCypher還將dNuc™技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測(cè)定產(chǎn)品中,，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)）,，dCyher™測(cè)定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）,。最近，EpiCypher還推出了針對(duì)ChIC、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析,。

如需了解更多詳細(xì)信息或相關(guān)產(chǎn)品,，請(qǐng)聯(lián)系EpiCypher中國(guó)授權(quán)代理商-欣博盛生物