對同一張組織切片上的兩種或多種抗原進行免疫組化定位,，有多種酶學方法可供選擇,。概括起來可分為兩大類： 
用相同的酶系統(tǒng)、不同的酶作用底物對每種抗原進行檢測,，或用不同的酶系統(tǒng)及其相應(yīng)的底物,，對每種抗原進行檢測,。 
目前Vector公司（國內(nèi)代理商欣博盛生物）所提供的可廣泛選擇的VECTORSTAIN® ABC kit試劑盒及底物試劑盒，上述兩種方法都適用,。 
Vector開發(fā)的許多獨-特的底物尤其適用于多抗原標記,。通常，過氧化物酶底物能產(chǎn)生更穩(wěn)定,、更密集的有色沉積物而能對抗原進行精確定位,；堿性磷酸酶底物較彌散；葡萄糖氧化酶相比而言靈敏度較低,，但當使用高濃度的一抗時,，也可作為第二種標記對抗原進行定位。 

雙抗原染色流程圖 

雙抗原染色實驗步驟 

1.組織標本制備,。脫蠟,、水化、抗原修復（可根據(jù)一抗說明書推薦方法進行操作）,。 
2.在蒸餾水中清洗5分鐘,。 
3.如存在內(nèi)源酶活性，可采用適當方法以消除內(nèi)源酶的作用,。（如3％H2O2-甲醇液中浸泡10分鐘,，以消除內(nèi)源性過氧化氫酶的作用）。 
4.用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）,。 
5.Avidin/biotin封閉,。 如有需要,，可進行Avidin/Biotin封閉（Avidin/Biotin 封閉試劑盒,，目錄號 SP-2001）。在Avidin溶液中孵育15分鐘,。用緩沖液清洗,，然后在Biotin 溶液孵育15分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次,。如已設(shè)置適當對照,，背景不需考慮時，也可省去此步,。 
6.蛋白封閉,。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘?；蛟?/span>10%的正常血清中孵育5-10分鐘,。 
7.一抗,。甩去多余封閉液，滴加適當濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit）,，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。在蒸餾水中清洗5分鐘。 
8.PBS洗2 分鐘/次×3次,。 
9.二抗,。滴加生物素化二抗，孵育30分鐘,。若孵育5-10分鐘,，需升高生物素化二抗的濃度。 
10.PBS洗2 分鐘/次×3次,。 
11.加入ABC復合物（預(yù)先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）,。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘,，需提高試劑濃度,。 
12.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
13.底物,。用適當?shù)拿傅孜镞M行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）,。請根據(jù)底物試劑盒中推薦的時間做參考。 
14.PBS洗2 分鐘/次×3次,。 
15.（此步起,，為對第2種抗原進行染色標記）Avidin/biotin封閉。此步可防止第2套標記試劑與第1套標記試劑相互作用,。在蒸餾水中清洗5分鐘,。 
16.蛋白封閉。用含5%正常血清的緩沖液孵育20分鐘,?；蛟?/span>10%的正常血清中孵育5-10分鐘。用PBS洗2 分鐘/次×3次（也可使用其他緩沖液）,。 
17.一抗,。甩去多余封閉液，滴加適當濃度的一抗（5%正常血清稀釋- VECTASTAIN® kit）,，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（或適當孵育時間）,。 
18.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
19.二抗,。滴加生物素化二抗,，孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘，需升高生物素化二抗的濃度,。 

20.加入ABC復合物（根據(jù)說明書預(yù)先制備的VECTASTAIN® ABC試劑）,。孵育30分鐘。若孵育5-10分鐘,，需提高試劑濃度,。 

21.PBS洗2 分鐘/次×3次。 
22.底物,。用適當?shù)牡?/span>2種酶底物進行孵育（可在顯微鏡下觀察至顯色最佳）,。請根據(jù)底物試劑盒中推薦的時間做參考。 23.用自來水沖洗5分鐘,。 
24.復染,、鹽酸酒精分化、封片,、鏡下觀察,。

優(yōu)質(zhì)免疫化學檢測酶底物 
       Vector公司能提供過氧化物酶底物、堿性磷酸酶底物和葡萄糖氧化酶底物,，以及DuoLuX 化學發(fā)光或熒光底物,。可用于堿性磷酸酶,，過氧化物酶和葡萄糖氧化酶,。均為濃縮型，試劑盒內(nèi)包括能配置成300ml工作液所需的所有試劑成分,，足以染色3000-6000張片,。試劑盒成分穩(wěn)定，4℃可保存一年,。酶底物反應(yīng)物有可溶性和非可溶性,，適合IHC、WB,、ISH,、ELISA等多種免疫化學檢測方法。

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