基于需要遞轉(zhuǎn)不同種類核酸/蛋白類型研究,，在細胞轉(zhuǎn)染環(huán)節(jié),，研究者們常碰到如下三類問題：

1,、細胞對化學試劑較為敏感,，轉(zhuǎn)染后,，細胞活率下降或死亡,；

2、研究常用細胞類型較多,，不同類型細胞,，轉(zhuǎn)染效率差異較大，導致單個轉(zhuǎn)染試劑或者實驗流程,，無法滿足實驗需求,；

3、遞轉(zhuǎn)多種類型核酸或蛋白,，需要挑選對應的轉(zhuǎn)染試劑,，并且需要大量實驗優(yōu)化，才可以得到較高的轉(zhuǎn)染效率,。

有沒有一款化學轉(zhuǎn)染試劑,，可以同時應對常規(guī)到難轉(zhuǎn)染的細胞類型，有著較低的細胞毒性,，并且適用于多種核酸/蛋白類型遞轉(zhuǎn)呢,？兼具多重功能、高性能的TransIT-X2®轉(zhuǎn)染試劑,，可同時應對常見細胞及難轉(zhuǎn)染細胞類型,，避免條件摸索,、大量的重復性實驗，輕松地得到您理想的實驗結(jié)果,。

● 已驗證在大多數(shù)細胞類型中(如貼壁/懸浮細胞,、原代細胞、神經(jīng)細胞等),，都有著優(yōu)異的轉(zhuǎn)染效率,、低毒性(特別相對于形成脂質(zhì)體復合物的Lipofectamine®系列試劑)、高性能的表現(xiàn),；

● 適用于多種研究領域,，包括不限于干細胞研究、基因編輯CRISPR研究,、RNAi基因干擾/沉默,、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建、低毒性的轉(zhuǎn)染實驗,、共轉(zhuǎn)染實驗等,；

● 允許高效且穩(wěn)定的同時遞轉(zhuǎn)多種核酸/蛋白類型，包括不限于質(zhì)粒 DNA,、siRNA/miRNA 和 CRISPR/Cas9 組分,。

圖1、Mirus產(chǎn)品年鑒

為什么 Mirus TransIT-X2® Dynamic Delivery System 有著如此高性能及廣泛適應性呢,？這歸因于Mirus強大且高效的專-利遞轉(zhuǎn)平臺設計,，可進行多重、多功能組合的轉(zhuǎn)染試劑組分篩選并優(yōu)化,。成立于1995年的Mirus,，專注及深耕核酸遞轉(zhuǎn)領域多年，從最早具有低毒性的TransIT ® -LT1到GMP級別,、可用于AAV和LV生產(chǎn)的TransIT-VirusGEN®,，都是基于該遞轉(zhuǎn)平臺進行設計及開發(fā)。直至文稿發(fā)布時,，使用Mirus產(chǎn)品發(fā)表文章已超過1萬篇，并且發(fā)表文章及Mirus數(shù)據(jù)庫涵蓋了超過1千2百種細胞類型,，更多文章及數(shù)據(jù)查詢,，請見訪問鏈接：因平臺限制，請聯(lián)系欣博盛生物獲取,。

圖2,、Mirus轉(zhuǎn)染試劑原理示意圖

不同于傳統(tǒng)基于單組分的轉(zhuǎn)染試劑(如陽離子聚合物或陽離子脂質(zhì)體)，為了進一步提高轉(zhuǎn)染效率,，以應對不同細胞類型或特定的應用,。Mirus將專-利的多聚物(Polymer)及脂質(zhì)(Lipids)技術(shù)進行多重組合,，在不形成脂質(zhì)體復合物(liposome，通常具有細胞毒性)前提條件下,，得到多種類,、高性能的轉(zhuǎn)染方案，克服細胞遞轉(zhuǎn)過程中的多重阻礙,，以實現(xiàn)更高效轉(zhuǎn)染和更低的細胞毒性(圖2),。

圖3、Mirus獨-有智能迭代設計,，轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化流程示意圖

基于上述Mirus強大,、高效的專-利遞轉(zhuǎn)平臺設計，在進行多重,、多組合篩選,、優(yōu)化及后續(xù)驗證。獨-有的智能迭代設計流程,，優(yōu)化轉(zhuǎn)染技術(shù)中的每個組分,。Mirus推出一系列經(jīng)典轉(zhuǎn)染試劑，以應對多種需求：

1,、廣譜,、高性能、低毒性的轉(zhuǎn)染試劑家族: TransIT-X2®,、TransIT®-LT1,、TransIT®-2020

2、針對特定細胞類型的轉(zhuǎn)染試劑家族：TransIT®-293,、TransIT®-BrCa,、TransIT®-CHO、TransIT-HeLaMONSTER®,、TransIT®-Insect,、TransIT®-Jurkat、TransIT®-Keratinocyte

3,、針對特定應用的轉(zhuǎn)染試劑家族：

★.病毒生產(chǎn)：VirusGEN® 轉(zhuǎn)染試劑及配套試劑盒,、TransIT®-Lenti

★.蛋白/抗體生產(chǎn)：TransIT-PRO®、CHOgro® Expression System,、CHOgro® High Yield Expression System

4,、寡核苷酸遞轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)染家族：TransIT®-Oligo、TransIT-siQUEST®,、TransIT-TKO®

5,、mRNA及長鏈RNA遞轉(zhuǎn)：TransIT®-mRNA

  Mirus TransIT-X2® 轉(zhuǎn)染試劑性能數(shù)據(jù) 展示圖  

4、TransIT-X2®Dynamic Delivery System在包括原代細胞多種細胞類型中,，具有較高轉(zhuǎn)染效率,。

Mirus TransIT-X2®Dynamic Delivery System遞轉(zhuǎn)表達EGFP質(zhì)粒DNA分別至A549,、CHO-K1、Hep G2,、MDCK,、LNCaP、PC-12,、原代人乳腺上皮細胞(HMEC)和正常人真皮成纖維細胞(NHDF)細胞中,。實驗使用96孔板， TransIT-X2®試劑加入量為0.2-0.4µl,，DNA加入量為0.1µg(使用試劑:DNA=2:1,、3:1或4:1)。轉(zhuǎn)染后48小時,，使用Guava® easyCyte™ 5HT流式細胞儀重復檢測三次,，評估轉(zhuǎn)染效率。

圖5,、相較于使用單一組分且形成陽離子脂質(zhì)體復合物(liposome)的Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,，TransIT-X2®有著更高的轉(zhuǎn)染效率及更低細胞毒性

使用TransIT-X2®(Mirus Bio)、Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific)或Lipofectamine®3000 (Thermo Fisher Scientific)轉(zhuǎn)染熒光素酶編碼質(zhì)粒DNA至A549 (A)或MDCK (B)細胞中,，轉(zhuǎn)染24小時,，通過熒光素酶活性評估轉(zhuǎn)染效率，定量受損細胞中釋放的LDH評估細胞毒性,。與Lipofectamine®2000或Lipofectamine®3000的細胞相比,，在最佳試劑:DNA比例下，Trans - x2®有著更高的熒光強度及更低的細胞毒性,。

實驗Tips: 針對更多特定細胞類型,，試劑使用建議，詳細請見：因平臺限制,，請咨詢欣博盛生物獲取

  Mirus TransIT-X2® 在RNAi干擾實驗中性能數(shù)據(jù)展示  

圖6,、不同RNAi干擾途徑示意圖

基因沉默相關功能研究在分子和細胞生物學中發(fā)揮著重要作用，化學轉(zhuǎn)染也在該研究領域扮演者重要角色,。常見參與RNAi干擾途徑的天然RNA分子包括：

★.小干擾 RNA (Small interfering RNAs, siRNA) ：由雙鏈 RNA(dsRNA)斷裂所產(chǎn)生的短雙鏈 RNA(20-25bp),；

★.微小 RNA(MicroRNAs, miRNAs) ：非編碼 RNA 處理后所產(chǎn)生的一類短的、單鏈 RNA(20-22nt),。

利用 RNAi 抑制基因表達的另一種方法為短發(fā)夾 RNA(short hairpin RNA , shRNA),，這些短 RNA 序列可通過病毒或非病毒載體方式進行表達，更多詳細信息可查閱Mirus Applications | RNAi Gene Silencing,。

請見訪問鏈接：因平臺限制，請咨詢欣博盛生物獲取

圖7,、基于siRNA核酸遞轉(zhuǎn)類型的基因沉默研究,，相比Lipofectamine® 2000,，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染siRNA(靶點為內(nèi)源性蛋白質(zhì)- GAPDH和AHA1)，對照使用正常人類真皮成纖維細胞(NHDF)遞轉(zhuǎn)非靶向siRNA,。Trans IT-X2®加入量為4µl,， Lipofectamine®2000加入量為6µl，siRNA加入量都為25 nM,。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平測量GAPDH或AHA1 mRNA進行檢測,，轉(zhuǎn)染后48小時均一化至非靶向?qū)φ战M的mRNA水平，誤差則為三次復孔實驗的標準差,。

圖8,、基于miRNA (miRNA Precursor及miRNA mimic)基因沉默研究，相比Lipofectamine® 2000,，TransIT-X2®有著更高的基因沉默效率

TransIT-X2®Dynamic Delivery System和Lipofectamine®2000轉(zhuǎn)染試劑用于轉(zhuǎn)染Pre-miR™ hsa-miR-1 miRNA Precursor 或者mirVana™ miRNA mimic, miR-1 (兩者都已驗證,，可降低PTK9 mRNA表達水平)。Pre-miR™陰性質(zhì)控用于評估mRNA表達水平基線值,。Trans IT-X2®及Lipofectamine®2000試劑加入量都為3µl,， 加入50 nM miRNA。使用qRT-PCR相對于18s rRNA水平,，經(jīng)過陰性質(zhì)控的均一化,，得到PTK9 mRNA表達水平值。

  Mirus TransIT-X2® 在CRISPR基因編輯實驗中性能數(shù)據(jù)展示  

經(jīng)過改造及優(yōu)化的細菌 CRISPR/Cas9 系統(tǒng),，已被廣泛應用到哺乳細胞的基因編輯中,。基于CRISPR基因編輯實驗常見兩組分：Cas9蛋白及引導RNA(gRNA),。當Cas9蛋白切割了靶向基因組DNA,，會觸發(fā)兩種內(nèi)源性修復機制，即非同源末端連接(NHEJ)和同源定向修復(HDR),，以應對細胞中產(chǎn)生的DNA斷裂,。基于NHEJ細胞修復通路,，為非精準,、且容易出錯細胞修復通路，可引入導致基因功能缺失的Indel,?；?/span>HDR的細胞修復通路，則需要額外的同源 DNA 作為修復模板,，從而實現(xiàn)“精準"修復,，在目的基因插入特定的基因或長片段序列。

【 根據(jù)研究者們不同的實驗需求 】 

CRISPR基因編輯可以有多種類型實驗設置,，這意味需要面對不同核酸類型的轉(zhuǎn)染甚至共轉(zhuǎn)染,，舉例如下：

1,、質(zhì)粒pDNA轉(zhuǎn)染

作為CRIPSR實驗關鍵兩組分：Cas9蛋白及gRNA，可以設計單個質(zhì)粒DNA,，共同表達兩組分(A),；或者使用兩質(zhì)粒系統(tǒng)，其中一個質(zhì)粒表達Cas9蛋白,，另外一個質(zhì)粒表達gRNA(B),；當使用Cas9切口酶(Nickase)，則需要兩條gRNA,，這時可能需要三質(zhì)粒系統(tǒng)的遞轉(zhuǎn)實驗,。

2、質(zhì)粒DNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

此時,，與上述實驗設計不同的是,，gRNA以寡核苷酸形式進行遞轉(zhuǎn)，這就意味著遞轉(zhuǎn)實驗需要同時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA以及RNA寡核苷酸(A和B),。

3,、mRNA及RNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染

為了避免由于質(zhì)粒DNA基因組整合而導致的脫靶效應，可以共轉(zhuǎn)染編碼Cas9蛋白的mRNA及gRNA (RNA寡核苷酸),。

4,、Cas9/gRNA RNP復合物遞轉(zhuǎn)

隨著Cas9蛋白及gRNA商品化趨于成熟，越來越多的研究者們選擇直接從第三方購買高保真Cas9蛋白,，以及有著額外化學修飾且在細胞內(nèi)更穩(wěn)定的gRNA寡核苷酸,。除了極大的縮短和簡化CRISPR實驗流程外，相對于質(zhì)?；蛘?/span>mRNA方式合成,，直接遞轉(zhuǎn)RNP復合物的方式有著更高的特異性及編輯效率。

實驗Tips: 針對上述不同CRISPR實驗設計及遞轉(zhuǎn)情形,，TransIT-X2® Dynamic Delivery System經(jīng)優(yōu)化的具體實驗說明

下載鏈接如下：

因平臺限制,，請咨詢欣博盛生物獲取

圖9、質(zhì)粒DNA和gRNA寡核苷酸共轉(zhuǎn)染：TransIT-X2®分別在293T/17,、U2OS和NHDF細胞中共轉(zhuǎn)Cas9質(zhì)粒DNA與gRNA(RNA寡核苷酸),，都有著較高的基因編輯效率(18-48%)

使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System  (2 µl/孔，24孔板, Mirus Bio)共轉(zhuǎn)染0.5 µg質(zhì)粒DNA(表達Cas9蛋白)及50nM 2-part gRNA (PPIB基因)至HEK293T/17, U2OS 及NHDF細胞中,，轉(zhuǎn)染后48小時,，T7E1驗證切割效率。

圖10,、Cas9/gRNA RNP復合體遞轉(zhuǎn)：相較于Lipofectamine®系列轉(zhuǎn)染試劑,，TransIT-X2®有著更高的切割效率

2-part gRNA (PPIB基因，IDT) 及Cas9 蛋白(PNA Bio)形成RNP復合體，分別使用TransIT-X2® Dynamic Delivery System(1 µl/孔,， Mirus Bio),、Lipofectamine® CRISPRMAX™ (1.5 µl/孔， ThermoFisher) ,、Lipofectamine® RNAiMAX (1.5 µl/孔, ThermoFisher) 、Lipofectamine® 3000 (1.5 µl/孔ThermoFisher) 遞轉(zhuǎn)至293T/17及U2OS細胞中,。測試gRNA兩種使用量(6 nM或12 nM),，相同Cas9 蛋白加入量(6 nM)，轉(zhuǎn)染后48小時,，T7E1驗證切割效率,。

  Mirus TransIT-X2® 產(chǎn)品優(yōu)勢  

?、新型基于多組分開發(fā)的廣譜型轉(zhuǎn)染試劑(適用于多種細胞,，包括難轉(zhuǎn)細胞),；

?、可同時轉(zhuǎn)染核酸及蛋白,，包括不限于DNA,，siRNA/miRNA和CRISPR/Cas9復合物；

?,、不形成脂質(zhì)體復合物,，降低細胞毒性；

?,、滿足多種應用：基因過表達,、基因沉默、基因編輯,、干細胞研究,、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等。

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