CUT&RUN技術(shù)使用完整的細胞或細胞核來繪制組蛋白翻譯后修飾（PTMs）和染色質(zhì)相關(guān)蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）的全基因組富集圖譜,。在EpiCypher，客戶經(jīng)常會問,，“我的細胞樣本適用于CUT&RUN技術(shù)嗎? "盡管大家希望所有細胞都可以表現(xiàn)出理想的適用性,，但事實并非如此。

在這里,，我們將討論EpiCypher在評估CUT&RUN實驗中細胞使用的主要標準,。通常情況下，不理想的樣本質(zhì)量=不理想的CUT&RUN數(shù)據(jù),。

1.細胞數(shù)量

為了獲得可靠精準的實驗數(shù)據(jù),，EpiCypher建議在CUT&RUN實驗中每個反應(yīng)使用500,000個細胞。在實驗過程中,，我們分兩次對細胞進行計數(shù)：第一次是在最初的細胞采集時,，第二次是將細胞固定在磁珠上之前。第二次計數(shù)的目的是確保在使用CUT&RUN緩沖液洗滌過程中沒有大量細胞樣本的丟失或細胞裂解的發(fā)生,。有關(guān)具體指導(dǎo)信息,，請點擊技術(shù)支持中心了解詳情。

CUTANA™ CUT&RUN成功將選定的目標細胞數(shù)減少到5000個,。需要注意的是,，使用較低的細胞數(shù)可能會降低CUT&RUN產(chǎn)量,，所以需要據(jù)此對文庫制備和測序進行調(diào)整。如果出現(xiàn)這些情況,，請點擊CUT&RUN Library Prep Kit手冊以獲得實用建議,。

2.細胞活力

EpiCypher在細胞收獲時就會測定細胞活力或“活細胞"的百分比。初始細胞的活力對于CUT&RUN實驗的成功至關(guān)重要,。低活力可能導(dǎo)致分析背景增加,、產(chǎn)量降低以及在實驗過程中細胞/磁珠出現(xiàn)聚集的問題。

值得注意的是,，細胞的最佳活力高度依賴于樣本類型,。例如，用于CUT&RUN實驗的K562細胞我們要求在培養(yǎng)收獲時有>90%的活力,。然而,，對于其他某些樣品類型或?qū)嶒灄l件，細胞的最佳活力可能較低,。

關(guān)于細胞活力和細胞計數(shù)方法的小提示

EpiCypher建議使用簡單的臺盼藍染色方法來計數(shù)細胞并確定初始細胞活力,。因為臺盼藍染料對細胞有毒，所以在添加染料后一定要立即計數(shù),。

有些細胞對臺盼藍高度敏感,。如果細胞在臺盼藍染色時顯示出較低的活力，但在培養(yǎng)過程中具有預(yù)期的形態(tài),、最小的裂解度且能正常生長,，那么這些細胞可能適用于CUT&RUN技術(shù),。對此,，我們建議使用濃度更低的臺盼藍染料或嘗試其他細胞計數(shù)方法（如碘化丙啶）來確認細胞活力。

3.細胞形態(tài)和完整性

CUT&RUN技術(shù)需要形態(tài)正常的完整細胞,。形態(tài)是指細胞形狀,，與組織來源和/或細胞在培養(yǎng)基中的生長方式有關(guān)。懸浮細胞,，如K562細胞,，通常來源于血細胞和/或腫瘤細胞，具有圓形和對稱的形態(tài),。由于貼壁細胞可以來源于上皮,、內(nèi)皮、神經(jīng)元或成纖維細胞組織,，因此表現(xiàn)出不同的形態(tài)和擴增特征,。例如，上皮細胞往往具有均勻的細胞形狀，可以在細胞培養(yǎng)板上成片生長,，而成纖維細胞表現(xiàn)出不對稱,、細長的形態(tài)，可用于研究細胞遷移,。

使用裂解或質(zhì)量差的細胞也會導(dǎo)致數(shù)據(jù)質(zhì)量低,。為了確保有效的樣品制備，EpiCypher在初始細胞采集和磁珠結(jié)合之前均會檢查細胞形態(tài)和細胞膜的完整性,。第二次檢查很重要,，因為一些樣品類型（例如FACS分離的細胞或來自組織的細胞）可能對CUT&RUN洗滌緩沖液中的裂解成分更敏感。在這些情況下,，我們建議在進行CUT&RUN實驗時分離細胞核（Figure 1）,。

Figure 1: Successful isolated K562 cell nuclei. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

4.細胞來源注意事項：細胞系、原代細胞,、組織和干細胞

細胞的形態(tài),、活力和數(shù)量會直接受到細胞來源的影響。CUT&RUN實驗使用的細胞可以來自組織,、細胞系,、培養(yǎng)的原代細胞或通過其他方式純化的細胞（例如FACS）。下面我們將討論這些細胞樣本的優(yōu)勢和面臨的挑戰(zhàn),。

√ 永生化細胞系

示例：HEK293,、HeLa、K562,、NIH/3T3,、MCF-7（Figure 2）、H1299（Figure 3）,、A549和THP-1細胞系,。

優(yōu)點：一般來說，細胞系是CUT&RUN技術(shù)中最容易優(yōu)化的input,。細胞系可以提供：

● 大量具有高活力的細胞——CUT&RUN實驗成功的關(guān)鍵。

● 精準且可高度重復(fù)的CUT&RUN實驗結(jié)果——源于細胞系的同質(zhì)性,。

● 用于藥物篩選,、基因過表達/抑制等的強大系統(tǒng)——不會破壞樣本質(zhì)量。

缺點：細胞系的使用有很多注意事項,，概述如下,。而根據(jù)實驗?zāi)康模毎悼赡苁亲罴训膩碓催x擇,。

● 一般來說,，細胞系不能代表體內(nèi)條件。它們通常來源于腫瘤細胞或其他病變細胞群，與原代細胞相比,，它們的功能可能不同,。

● 細胞系容易發(fā)生基因組改變，包括染色體異常,、重復(fù)和/或遺傳漂移,。

● 被其他細胞系污染很常見。錯誤細胞系的鑒定結(jié)果可能會妨礙測定的重現(xiàn)性,，并導(dǎo)致錯誤的生物學結(jié)論,。

Figure 2: MCF-7 breast cancer cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 原代細胞

示例：來源于活體組織樣品，固體（如腸,、肺,、肝、皮膚）或液體（如血液）,，經(jīng)過或未經(jīng)過細胞培養(yǎng)的均可,。

優(yōu)點：原代細胞經(jīng)常用于CUT&RUN，因為研究者使用它們可以：

● 探究在天然異質(zhì)的細胞環(huán)境中染色質(zhì)的功能和生物學機制,。

● 研究通過FACS或其他技術(shù)分離的稀有細胞的功能狀態(tài),。

● 確定細胞對體內(nèi)刺激或藥物治療的反應(yīng),。

● 表征患者樣本（例如腫瘤VS.健康細胞）,。

缺點：原代細胞的缺點取決于研究的組織和細胞類型。在研究原代細胞時,，可能面臨的挑戰(zhàn)有：

● 分離足夠數(shù)量的細胞——在分離過程中細胞的敏感性（如FACS）或在組織中的低豐度,。

● 獲得具有高活力的細胞——原代細胞通常需要小心處理以防發(fā)生裂解,。

● 擴大培養(yǎng)——原代細胞在培養(yǎng)基中的生長能力通常僅限于幾個階段，需要仔細規(guī)劃并優(yōu)化實驗時間表,。

● 獲得一致的實驗結(jié)果——特別是來源于含有許多不同細胞類型的大塊組織,。

Figure 3: H1299 non-small cell lung carcinoma cells in culture. Image by Liz Albertorio-Sáez M.Sc.

√ 干細胞

示例：誘導(dǎo)多能干細胞（iPSCs）、間充質(zhì)干細胞和胚胎干細胞,。

優(yōu)點：生長和培養(yǎng)多能干細胞群和成體干細胞群的功能使以下研究成為可能：

● 研究細胞發(fā)育,、分化和疾病發(fā)展過程中的表觀遺傳學變化。

● 生成用于功能分析和治療開發(fā)的稀有細胞類型,。

● 開發(fā)用于個性化醫(yī)療應(yīng)用的患者特異性細胞群,。

● 使用二維細胞和/或類器官培養(yǎng)研究細胞的生長和分化。

缺點：盡管干細胞在細胞和基因治療研究以及發(fā)育生物學方面有前景,，但干細胞的研究在許多方面都面臨挑戰(zhàn)：

● 干細胞培養(yǎng)需要豐富的經(jīng)驗,，即便如此，擴增某些干細胞群也很困難,。

● 培養(yǎng)干細胞需要多種質(zhì)控措施和精確的監(jiān)測,，成本高且耗時。

● 不同研究人員之間的分化方案可能會有所不同，從而引入意想不到的偏差和變化,。

EpiCypher的注冊商標和知識產(chǎn)權(quán)可見Epicypher品牌,。

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關(guān)于EpiCypher公司：

EpiCypher是一家成立于2012年的表觀遺傳學公司。從專有組蛋白肽陣列平臺EpiGold™開始,，EpiCypher開發(fā)了一系列同類產(chǎn)品,。同時，EpiCypher是重組核小體制造和開發(fā)的全球領(lǐng)-導(dǎo)者,。利用其獨-有技術(shù),，不斷增加產(chǎn)品庫中高純度修飾重組核小體（dNucs™）產(chǎn)品。dNuc™多樣性的產(chǎn)品為破譯組蛋白編碼和加速藥物開發(fā)提供了強大的工具,。

EpiCypher還將dNuc™技術(shù)廣泛的應(yīng)用于多種分析測定產(chǎn)品中,，包括：SNAP-ChIP®Spike-in Controls（用于抗體分析和ChIP定量）， EpiDyne®底物（用于染色質(zhì)重塑和抑制劑篩選及開發(fā)）,，dCyher™測定（用于探究表觀遺傳蛋白質(zhì)-組蛋白PTM結(jié)合相互作用）,。最近，EpiCypher還推出了針對ChIC,、CUT&RUN和CUT&Tag的高靈敏度表觀基因組圖譜CUTANA™分析,。

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