首頁 >> 公司動(dòng)態(tài) >> 生物實(shí)驗(yàn)室那些小竅門~
竅門在實(shí)驗(yàn)室中無處不在,。
如：平行作不同樣本的PCR,模板DNA加量一樣，配置PCR體系可以一起配制后分裝----這點(diǎn)做過試驗(yàn)的都知道,，但是配制的時(shí)候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點(diǎn)(如用100微升則配110微升),，這樣可以避免有時(shí)候分裝不夠的尷尬，因?yàn)椴煌貏e是大小不同的槍,，會(huì)有誤差,。再比如：sds-page膠預(yù)配(APS和TEMED、或者后者先不加)的問題,，實(shí)際上時(shí)間放置過長(zhǎng)肯定影響效果,，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板,，何嘗不可?又比如，配sds-page膠的時(shí)候,，上層膠和下層膠可以只用一個(gè)大槍頭：先取膠,，次取水，取6.8的tris后再取8.8的tris,，省時(shí)省料。
但我想,，“竅門”和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系,。其實(shí)，不管是那一類的小竅門,，都是在充分地理解實(shí)驗(yàn)各步驟的原理,、經(jīng)過多次試驗(yàn)積累、再加上一點(diǎn)點(diǎn)思索然后嘗試的結(jié)果,。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索,，是根本。否則,，別人的小竅門對(duì)你也未必能夠有用,。才進(jìn)實(shí)驗(yàn)室的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實(shí)的操作,，然后才能弄“竅門”,。本末倒置，貽害無窮,。
1. SDS －PAGE的積層膠
分離膠預(yù)先配成mixture,，APS制膠時(shí)加入，半年內(nèi)使用,，沒有問題,，我保證。
2. 做SDS-PAGE的時(shí)候
除了蛋白量上樣一致,，體積也一致,，這樣跑出來的膠各個(gè)泳道之間的band能做到一樣寬，方便后面的比較,，特別是WB,。做法就是拿1X的上樣緩沖補(bǔ)全要加的樣做到體積一致，否則跑出來會(huì)有的寬有的窄,，特別是上樣體積相差較大的,。
3. 在把蛋白膠做成干膠時(shí)
很多時(shí)候會(huì)因?yàn)橛袣馀菔鼓z裂掉，我的經(jīng)驗(yàn)是在做膠時(shí)加上層膜前在膠上多加些水就不容易進(jìn)氣泡了,，還有就是高溫烘膠,，我喜歡放到60度烘箱里烘,，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會(huì)有影響,，呵呵,，這是經(jīng)驗(yàn)之談，我從來都沒失手過,，大家可以試試,。
4. 做大腸表達(dá)時(shí)
確定蛋白是否表達(dá)一般要煮樣做誘前誘后檢測(cè),但很多時(shí)候煮出來的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用8M Urea重懸細(xì)菌再煮效果會(huì)有極大改善。
注:不能用Gu-HCl代替,。
5. 幾個(gè)偷懶的方法
1. 做SDS-PAGE跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要>1h,所以如果想第二天睡個(gè)懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會(huì)有氣體,所以需要加一點(diǎn)電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放4度過夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國(guó)外好多公司出售腳既是如此,可以保存上星期,。
2. 配置分離膠或者非變性膠時(shí)因膠凝時(shí)收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入4度以降低凝聚速度,而將凝膠放入37度促聚,并隨時(shí)用4度加剩的膠補(bǔ)充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成~10度角也可以減少收縮的影響。
3.推薦一個(gè)節(jié)約抗體/時(shí)間的做法:
同時(shí)跑2塊膠,同時(shí)轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入同一封口膜同時(shí)封閉,同時(shí)一抗二抗(是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時(shí)間幫它們翻個(gè)身以保證兩張膜的正面都有機(jī)會(huì)與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強(qiáng)洗膜也可以不做.我多一張盤子里放4張膜而沒有影響洗膜).可分別或同時(shí)壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時(shí)間而不會(huì)影響結(jié)果,。
或者另外一個(gè)就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾張膜呢.但每次都會(huì)減弱,效果不如上面一種方法,。
6. 做western blotting 轉(zhuǎn)膜時(shí)
膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時(shí)間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝 好轉(zhuǎn)膜裝置,，我的經(jīng)驗(yàn)是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker條帶,，方便的很。因?yàn)楹芏鄷r(shí)候跑電泳時(shí)膠上的預(yù)染maker很清楚,，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了,。不過要注意畫好預(yù)染maker后就不要使膠和膜發(fā)生對(duì)位移動(dòng)了，以防m(xù)aker失去參照價(jià)值,。
7. 超濾合適用于蛋白的濃縮
更換緩沖液和除鹽,，對(duì)于按照分子量進(jìn)行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實(shí)是有很大差別的,。
8. 關(guān)于Western Blot
1)器具的清潔非常重要,，開始做前，為了安全,，尤其是裝膠的厚薄玻璃板,，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2-3遍,，然后用去離子水沖洗一遍,。后用95%酒精再擦一遍后晾干備用。
2)配膠現(xiàn)用現(xiàn)配,，先配下層膠(分離膠),，后配上層膠(濃縮膠或積層膠)，而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻,，即用移液槍抽吸與注入1-2次即可,。
9 跑蛋白page的時(shí)候
一開始用加樣針，太麻煩,，發(fā)現(xiàn)用20ul槍+普通小白槍頭點(diǎn),，非常省事,。另外，點(diǎn)樣時(shí)有可能看不清孔在哪,，看遠(yuǎn)離你的那面膠,，孔有反光的。點(diǎn)樣也點(diǎn)你對(duì)面的那塊膠,，省的總低頭,，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己,。
10. 垂直電泳時(shí)
可在電泳糟中放入青霉素小瓶等,，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液,。
11. 我們有時(shí)要沉淀東西時(shí)
由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒沉淀下來東西,，由于量很少,，不好觀察，所以離心時(shí)建議按特定的方向放置離心管,，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位,，這樣離心后就可直接觀察那有沒有沉淀，避免滿管子找,，另外看沉淀時(shí)可以對(duì)光看,，這樣就是顆粒狀的細(xì)小沉淀也能看見的。
12. 大家都知道PMSF有毒
以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實(shí)也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積,，到達(dá)你所要的濃度,。這樣就避免了你長(zhǎng)時(shí)間和它接觸。
13. 跑好SDS-PAGE膠的一些體會(huì)：
1. 清洗好玻璃板,，不要偷懶,，很多時(shí)候跑完電泳撬膠時(shí)會(huì)因?yàn)椴ＡО宀桓蓛裟z粘在板上把膠撬破。
2. 配膠時(shí)不要反復(fù)用槍混,，稍微搖混就可以了,，用槍混多次會(huì)導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。
3. AP分裝成500微升一管保存放-20度,，避免AP用太久失效,。
4. 倒膠時(shí)把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因?yàn)槲⒘康乃嬖跁?huì)影響配的膠濃度,。
5. 盡量不用過夜放室溫或者四度的膠,，也回影響膠 的分離效果。
6. 電泳完撬膠時(shí)根本不需要用撬膠板,，在一平皿里裝好水,，把有膠一面的放在水中晃動(dòng)幾次膠很容易就脫落下來,，一點(diǎn)沒有問題，方便的很,。
7. 點(diǎn)樣時(shí)樣品別忘了離心這步,，因?yàn)樯蠘雍泄腆w沉淀會(huì)影響電泳圖分辨效果。
8. 盡量在冰浴狀態(tài)下跑,。
14. 關(guān)于２－ＤＥ
總結(jié)了幾個(gè)小竅門：
1.一向電泳時(shí),，鹽離子容易聚在 膠槽的兩側(cè).剪一小段IPG膠條放在兩側(cè)，構(gòu)成鹽橋,，電壓就容易上去了,。避免一向電泳不好影響后實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. SDS-PAGE時(shí),在灌膠之前,一般大家都會(huì)用凡士林封底, 在SDS-PAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,我的經(jīng)驗(yàn)是:不用凡士林,取少量未加Ap的分離膠,按比例加2倍量的Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠方面,效果好!
15. 蛋白質(zhì)純化時(shí)
蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān),，之前建議加pmsf,，建議在上柱子洗脫的時(shí)候也加pmsf(蛋白降解抑制劑)，一定要用之前再加,。
16. 做透析的時(shí)候
拿一個(gè)5ml的槍頭或者是其他類似的東西,，剪短，穿過個(gè)塑料泡沫之類的面積比燒杯大東西,，然后把透析帶一端扎緊,，另一端開口綁緊在5ml槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過來綁成u字型,。這樣就可以用1ml的槍穿過5ml的槍頭的孔,，另一只手調(diào)整透析帶，來加樣取樣,，省去了總綁透析帶的麻煩,，對(duì)同一個(gè)蛋白大量多次透析非常方便
17. 自己的實(shí)驗(yàn)技巧
1. 配SDS-PAGE膠時(shí)，用槍頭混勻比較麻煩,，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，效果也不好?？梢约粢恍《螉A文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里,，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了,，直接灌膠即可,。
2. 上面的站友也說過，上樣用黃槍頭就行,，我也一直在用,，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試,。
3.電泳后考馬斯亮藍(lán)染色一般要1h到2h,，脫色也要2h左右，麻煩的很?，F(xiàn)在給大家說一個(gè)簡(jiǎn)單的方法,，是我從一個(gè)師姐那里學(xué)到的。加入染色液后,，先放入微波爐里加熱5-10秒,，使染色液微熱即可(千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了),。然后放水平搖床上搖20分鐘,，多半小時(shí)就染好了。
脫色也很簡(jiǎn)單,，不用脫色液,，直接用去離子水，放微波爐里煮沸5分鐘左右,，然后將水倒掉,，再換上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次,，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點(diǎn)點(diǎn),，不如那樣清楚,，只要電泳時(shí)比平時(shí)多上1/5的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時(shí)省材料(用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液),。
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