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高速冷凍離心機在分離細胞核基質(zhì)中的應(yīng)用
核基質(zhì)是指真核細胞間核中除核被膜、染色體和核仁以外的一個精密網(wǎng)架系統(tǒng),，既包含蛋白質(zhì),，又包含RNA。核基質(zhì)是從純化的細胞核中分離的,。要用去污劑,、核酸酸處理細胞核。以分離核基質(zhì)的每一步中抑制核酸酶的活性非常重要,。
本文介紹1986年Comerford使用過的分離細胞核基質(zhì)的方法和步驟,。
1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎,，加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2,、250mmol/L蔗糖,、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,，4℃),。勻漿后通過幾層紗布過濾，在4℃,，勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機,，4*100ml轉(zhuǎn)子，2100r/min)離心10分鐘,。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里,，該緩沖液包含56%(質(zhì)量濃度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機,，A641轉(zhuǎn)子,，28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次,。
2. 把細胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl,，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖,、1mmol/L EGTA,、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)],，加入四硫酸鈉,，終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后,，加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,，NEM)，終濃度為5mmol/L,。
3. 在800 gmax離心沉淀細胞核,，并用20mL STEM洗三次，把細胞核重新懸浮在20ml STEM中,，補加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I),，在37℃孵育20分鐘，再在800 gmax離心回收沉淀,。
4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液：10mmol/L Tris-HCl,，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4,，4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀,。
5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質(zhì)量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度,，各2ml 60%,，50%和40%(質(zhì)量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時,，細胞核基質(zhì)在40%和50%蔗糖分離界面,。回收后用STEM緩沖液(10ml)洗一次,。
該方法可用于各種類型細胞核基質(zhì)的分離,。
本文介紹1986年Comerford使用過的分離細胞核基質(zhì)的方法和步驟,。
1. 大鼠肝臟(50~100g)剪碎,，加3倍體積的10mmol/L Tris-HCl、2mmol/L MgCl2,、250mmol/L蔗糖,、1mmol/L EDTA、1mmol/L PMSF(PH=7.4,，4℃),。勻漿后通過幾層紗布過濾，在4℃,，勻漿液以800gmax(用的是MSE Chilspin離心機,，4*100ml轉(zhuǎn)子，2100r/min)離心10分鐘,。把沉淀重新懸浮在勻漿緩沖液里,，該緩沖液包含56%(質(zhì)量濃度)蔗糖，再在4℃以60000gmax(用Sorvall OTD50超速離心機,，A641轉(zhuǎn)子,，28000r/min)離心90分鐘。把沉淀用20mL勻漿緩沖液洗兩次,。
2. 把細胞核沉淀重新懸浮在20mL STEM緩沖液中[STEM：50mmol/L Tris-HCl,，50mmol/L MgCl2、250mmol/L蔗糖,、1mmol/L EGTA,、1mmol/L PMSF(PH=7.4，4℃)],，加入四硫酸鈉,，終濃度為0.2mmol/L。在4℃孵育后,，加入N-乙酰馬來酰亞胺(N-ethylmaleimide,，NEM)，終濃度為5mmol/L,。
3. 在800 gmax離心沉淀細胞核,，并用20mL STEM洗三次，把細胞核重新懸浮在20ml STEM中,，補加20μg/mL DNase I(Boehringer, grade I),，在37℃孵育20分鐘，再在800 gmax離心回收沉淀,。
4. 把沉淀懸浮在20mL LS緩沖液里[LS緩沖液：10mmol/L Tris-HCl,，0.2mmol/L MgCl2、1mmol/L EGTA、10mmol/L PMSF(PH=7.4,，4℃)] ,在4℃孵育10分鐘, 再在800 gmax離心10分鐘回收沉淀,。
5. 把沉淀重新懸浮在1mL 含有70%(質(zhì)量濃度)蔗糖的LS緩沖液里。上面鋪放3層蔗糖梯度,，各2ml 60%,，50%和40%(質(zhì)量濃度)蔗糖(用含2mol/L NaCl的LS緩沖液配制蔗糖溶液)。在800 gmax離心1小時,，細胞核基質(zhì)在40%和50%蔗糖分離界面,。回收后用STEM緩沖液(10ml)洗一次,。
該方法可用于各種類型細胞核基質(zhì)的分離,。