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線粒體提取試劑盒使用說(shuō)明

 一,，試劑盒組份

二，說(shuō)明

線粒體提取試劑盒用于從動(dòng)物細(xì)胞或組織中分離出完整而純化的線粒體,。適合于動(dòng)物軟組織（肝或腦組織）和硬組織（肌肉）以及培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體的制備,。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細(xì)胞凋亡,、信號(hào)傳遞,、代謝和蛋白組學(xué)等的研究。

三,，操作步驟

1. 樣本處理

a. 組織勻漿：稱取100~200 mg新鮮組織如肝臟,、腦、心肌等,，PBS或生理鹽水沖洗,，洗凈血水，濾紙吸干,，用剪刀剪為碎塊放入小容量玻璃勻漿器內(nèi),。加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer，0℃冰浴上下研磨組織20次,；

b. 培養(yǎng)細(xì)胞勻漿：消化細(xì)胞,，PBS洗滌，800 × g 5~10 min離心收集細(xì)胞,。計(jì)數(shù),。每次提取需要5 × 10⁷個(gè)細(xì)胞，加入1.0 mL冰預(yù)冷的Lysis Buffer重懸細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小容量玻璃勻漿器內(nèi),，0℃冰浴研磨30~40次；

2. 將組織或細(xì)胞勻漿物轉(zhuǎn)移到離心管,，4℃,，1000× g 離心5 min,；

3. 取上清，加入一新的離心管中,，4℃,，1000× g 再次離心5 min。

4．取上清,，加入一新的離心管中,，4℃， 12,000 × g 離心10 min,。離心后的上清含胞漿成分,，可從中提取胞漿蛋白。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管,，線粒體沉淀在管底,；

5. 在線粒體沉淀中加入0.5 mL  Wash Buffer重懸線粒體沉淀，4℃,，1000× g 離心5 min,；

6．取上清，加入一新的離心管中,，4℃,， 12,000 × g 離心10 min。棄上清,，高純度的線粒體沉淀在管底,；

6. 用50 -100μL Store Buffer 或合適的反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，立即使用或-70℃保存,。

四 注意事項(xiàng)：
1. 為保證獲得完整的線粒體,，*是全程低溫操作。第二是快速,。第三,，在不破壞亞細(xì)胞器的情況下破碎細(xì)胞是制備線粒體的zui關(guān)鍵環(huán)節(jié)。與組織塊相比,，培養(yǎng)細(xì)胞特別是貼壁培養(yǎng)細(xì)胞在用玻璃勻漿器勻漿時(shí)較難破壁,，因而要選用小容量玻璃勻漿器、間隙嚴(yán)密的研杵上下研磨培養(yǎng)細(xì)胞,。
2. 以離心力g計(jì)算正確的離心速度,，不同的離心機(jī)可據(jù)此精確計(jì)算離心速度。
3. 進(jìn)行Western Blot和2D-膠電泳,，可直接加入上樣緩沖液裂解線粒體,。

五 儲(chǔ)存：四周內(nèi)使用可4℃儲(chǔ)存，長(zhǎng)期置-20℃

轉(zhuǎn)速與離心力換算

G＝1.11×(10^-5)×R×[rpm]^２
G為離心力,，一般以ｇ（重力加速度）的倍數(shù)來(lái)表示,；

 [rpm] ２即：轉(zhuǎn)速的平方,； R為半徑，單位為厘米,。