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SABC雙標(biāo)試劑盒說(shuō)明書

 試劑盒組成:

1，  封閉液：10ml,，5%BSA

2,，  生物素化二抗：濃縮液100ul,。

3，  SABC-FITC:濃縮液100ul,。

4,，  SABC-POD:濃縮液100ul。

5,，  稀釋液：30ml,。

6，  顯色液:20×DAB顯色液A,20×DAB顯色液B

7,，  抗熒光衰減封片劑

試劑盒簡(jiǎn)介：

本試劑盒適合于一抗為小鼠/兔IgG/山羊的免疫組化實(shí)驗(yàn). DAB及FITC顯色,。

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測(cè)而設(shè)計(jì)的，用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布,。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì),，同親和素一樣，對(duì)生物素有*的親和力,，親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)（IP=10）,，經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性,，對(duì)組織和細(xì)胞的非特異吸附很低,，基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個(gè)左右的過(guò)氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物,。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性,。

自備試劑：

1．粘片劑多聚賴氨酸。

2． 0.01 M PBS（pH7.2-7.4）

3． 0.01M檸檬酸鈉緩沖液

4,、抗熒光衰減封片劑

 實(shí)驗(yàn)步驟:

以石蠟切片熱修復(fù)為例

1. 切片常規(guī)脫蠟至水,。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶（如果FITC，剛可省掉此步）,。蒸餾水洗3次,。

2．熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）,電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔5-10分鐘后,，反復(fù)1-2次,。冷卻后PBS（pH7.2-7.6）洗滌1-2次。

3．滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘,。甩去多余液體, 不洗,。

4．用稀釋液將一抗（如兔抗IL-10）按一定比例稀釋（稀釋后的一抗4℃可保存一周），也可另行購(gòu)買抗體稀釋液,。滴加稀釋的一抗,，37 ℃ 1小時(shí)左右或20℃時(shí)2小時(shí)左右。也可4℃過(guò)ye,。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次,。（一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度,、背景有直接關(guān)系,。一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)性染色強(qiáng)度不夠時(shí),，可提高一抗?jié)舛群脱娱L(zhǎng)孵育時(shí)間,；背景過(guò)高時(shí)，可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間,。）

5．根據(jù)使用量,用稀釋液將生物素化二抗?jié)饪s液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液,。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗2分鐘×3次,。

如果想用熒光觀察,，請(qǐng)接下面步驟，如果想用DAB顯色,，請(qǐng)?zhí)^(guò)6-7,。

6．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液，混勻即成SABC-FITC工作液,。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃,，30分鐘(避光),。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次。

7．滴加抗熒光衰減封片劑封片,。熒光顯微鏡觀察,。

如果想用DAB顯色，請(qǐng)接8,。

8．根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液，混勻即成SABC-POD工作液,。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃,，30分鐘。PBS（pH7.2-7.4）洗5分鐘×4次,。

9．DAB顯色:根據(jù)用量,，用PBS（pH7.2-7.4）配制，按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A,，加入50ul 20×DAB顯色液B ,。混勻后加至切片,。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,，一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng),。

10．蘇木素輕度復(fù)染,。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察,。

對(duì)于細(xì)胞片,，常規(guī)固定后，PBS漂洗兩次,，再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘,，PBS漂洗兩次，3%H2O2（如果FITC,，剛可省掉此步）處理15分鐘,；PBS漂洗兩次，下接上面第4步,。

對(duì)于冰凍切片,，固定后，可用PBS漂洗兩次,，再接上面第二步,。

注意事項(xiàng)：如果染色背景過(guò)高，在SABC反應(yīng)之后,，DAB顯色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次,，PBS洗2次,，然后DAB顯色。

因?yàn)槊庖呓M化指標(biāo)眾多,，標(biāo)本不一,，此步驟僅作參考。

注意事項(xiàng)：如果染色背景過(guò)高,，在SABC反應(yīng)之后,，用加有0.01—0.02% TWEEN-20的PBST（pH7.2-7.4）洗滌切片4次，PBS洗2次,，然后封片觀察,。