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此細(xì)胞凍存液主要是由血清和DMSO組成,，適合于大多數(shù)細(xì)胞的凍存，其凍存方法與常規(guī)方法相同,。

細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

一,、原理

在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時(shí),，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶,，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水、PH改變,、蛋白變性等,，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑,，可使冰點(diǎn)降低,。在緩慢的凍結(jié)條件下,，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成,。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快,，使之迅速通過細(xì)胞zui易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng),，活力受損不大,。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無毒性,，分子量小,，溶解度大，易穿透細(xì)胞,。

二,、操作步驟

（一）凍存
1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二）,，將細(xì)胞懸液收集至離心管中,。
2、1000rpm離心10分鐘,，棄上清液,。
3、沉淀加細(xì)胞凍存液,，輕輕吹打均勻,，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右,。
4,、將懸液分至凍存管中，每管1 ml,。
5,、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口,，封口一定要嚴(yán),，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。
6,、貼上標(biāo)簽,，寫明細(xì)胞種類，凍存日期,。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩,。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮,。
注意：操作時(shí)應(yīng)小心,，以免液氮凍傷,。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充,，不能揮發(fā)干凈,，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復(fù)蘇
1,、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞,，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2,、從液氮中取出凍存管,、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化,。
3,、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中,。
4,、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液,。
5,、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻,，再離心10分鐘,，棄上清液。
6,、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況,。

三,、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）,、離心管,、吸管、離心機(jī)等
試劑：0.25％胰酶,、培養(yǎng)基,、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）