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 細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的基本特征之一，在機(jī)體的胚胎發(fā)育,、組織修復(fù),、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V是一種分子量為35.8KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白,，能與細(xì)胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）高親和力特異結(jié)合,。FITC-Annexin V結(jié)合到凋亡細(xì)胞后，在藍(lán)色光的激發(fā)下,，發(fā)出綠色熒光,，區(qū)分出凋亡細(xì)胞與正常細(xì)胞。碘化丙啶（Propidium iodide,，PI）是一種核酸染料,，它不能穿透完整細(xì)胞膜,，但對(duì)凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染,。將FITC-Annexin V與PI匹配使用,，可以將凋亡早期的細(xì)胞和晚期的細(xì)胞區(qū)分開來。 
    
    
    產(chǎn)品特點(diǎn) 
    檢測(cè)快速簡(jiǎn)單,，僅需10 分鐘,，一次測(cè)試即可； 
    組成為: FITC-Annexin V,；結(jié)合緩沖液,；碘化丙啶 
    和DNA檢測(cè)方法相比，能夠更早地檢測(cè)到凋亡細(xì)胞,。 
    

    操作步驟 
    1. 整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105-1×106個(gè)/ml,。
    2. 取1ml細(xì)胞，1000rpm,，4℃離心10分鐘,，棄上清。
    3. 加入1ml冷的PBS,，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮,，1000rpm，4℃離心10分鐘,，棄上清（對(duì)于貼壁細(xì)胞,，先用胰酶消化，再用PBS洗滌）,。
    4. 重復(fù)步驟3兩次,。
    5. 將細(xì)胞重懸于200μl Binding Buffer。
    6. 加入10μl Annexin V-FITC和10μl PI,，輕輕混勻,，避光室溫反應(yīng)15分鐘 或4℃反應(yīng)30 
    分鐘。
    7. 加入300ul Binding Buffer,，在1小時(shí)內(nèi)上機(jī)檢測(cè),。
    8. 若用熒光顯微鏡檢測(cè)，將細(xì)胞混合液離心,，取細(xì)胞沉淀涂片,，再進(jìn)行觀察。 
    
    保存條件 
    貯存于 2-8°C,。建議Annexin V-FITC打開后,，分裝成小份凍存于-20°C。 
    
    注意事項(xiàng) 
    為保證得到理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在使用此試劑盒之前請(qǐng)認(rèn)真閱讀該注意事項(xiàng)。 
    
    旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請(qǐng)短暫離心,，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底,，避免開蓋時(shí)液體灑落。 
    Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質(zhì),，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光,。 
    Propidium iodide（PI）能通過皮膚吸收，對(duì)眼睛有刺激作用,。 
    在細(xì)胞洗滌的zui后一步,，請(qǐng)盡量將上清棄凈，以免PBS殘留,，有可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。 
    PI染色時(shí)間過長(zhǎng)有可能造成檢測(cè)的凋亡率偏高，建議首先進(jìn)行Annexin V-FITC染色,，上機(jī)前5分鐘再加入PI染色,。 
    整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔,，勿用力吹打細(xì)胞,，盡量在4℃下操作。 
    反應(yīng)完畢后請(qǐng)盡快檢測(cè),，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程,，反應(yīng)1小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開始衰變。 
    成功的檢測(cè)凋亡受以下幾種因素的影響,，如細(xì)胞類型,、細(xì)胞膜上PS的密度、發(fā)生凋亡時(shí)PS翻轉(zhuǎn)的比例,、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方法,、所用試劑、誘導(dǎo)凋亡的時(shí)間等,，把這些影響因素進(jìn)行優(yōu)化對(duì)實(shí)驗(yàn)成功是非常必要的,。 
    此試劑盒僅供科研使用。