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主營產(chǎn)品： 進口透析袋,密理博ECL發(fā)光液,B27無血清培養(yǎng)基,Gibco膠原酶 |
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2023-7-25 閱讀(1150)
共聚焦實驗中培養(yǎng)耗材的選擇
激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細胞內(nèi)已經(jīng)標記好的蛋白質(zhì)和分子,，為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測方法,。如今，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個非常常規(guī)的實驗操作,，應(yīng)用于生物學(xué)各個研究領(lǐng)域中,。在細胞實驗中，如果要進行一次激光共聚焦成像,，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外,，樣品的準備也是非常重要的一環(huán)。
爬片的使用
由于激光共聚焦實驗對觀測耗材的底部有著比較高的要求,，普通的培養(yǎng)皿,，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。
1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細胞載體,。但是使用蓋玻片,，在實驗操作上是非常麻煩的，有時候需要將蓋玻片清洗并且烘干滅菌,，才能開始使用,。2.細胞爬片，雖然不需要清洗,，但是還是需要進行包被才能讓細胞正常貼壁生長,。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細胞,，熒光染色后,，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進行成像,。如圖一所示：
圖一：使用蓋玻片和細胞爬片的做免疫熒光方法示意圖,。
玻底培養(yǎng)皿/板的使用方法
這里要介紹的方法，大大簡化了樣品準備流程,，需要用到專為共聚焦實驗設(shè)計的共聚焦培養(yǎng)皿,。共聚焦培養(yǎng)皿的底部為0.16-0.19mm的硼硅酸鹽玻璃，結(jié)合了標準培養(yǎng)皿/板的便利性和蓋玻片的成像優(yōu)勢,，可提供高倍放大顯微鏡及共聚焦圖像分析所需的最佳光學(xué)特性,。
所有的操作都在培養(yǎng)皿中進行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗,，滅菌,，包被程序（流程如圖二所示）
圖二：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準備樣品流程，可以直接進行細胞培養(yǎng)－染色－成像操作
操作流程
1. 在超凈臺中打開共聚焦專用培養(yǎng)皿的滅菌包裝,，拿出培養(yǎng)皿,，加入細胞懸液，蓋上皿蓋,，放入培養(yǎng)箱中靜置，等待細胞貼壁,。常規(guī)細胞培養(yǎng),，待細胞長置合適密度再取出，進行免疫熒光染色,。
2. 吸出培養(yǎng)基,，以PBS清洗細胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細胞,。
3. 20分鐘后,，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100
4. 10分鐘后,，吸出Triton,，清洗細胞后加入BSA封閉。
5. 加入抗體熒光染色后,，吸出所有試劑,，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像,。
使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個好處：往往一個共聚焦掃描成像持續(xù)時間很長,，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋,，可以減少揮發(fā),。
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