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QIAGEN REPLI-g Mini Kit 全基因組擴增試劑

用于從小或珍貴樣品中進行高度均一的全基因組擴增

• 易于擴增，產(chǎn)量高達(dá)10μg
• 基因組基因座的無偏差擴增
• 多位移放大（MDA）帶來可靠的結(jié)果
• 擴增的DNA非常適合大多數(shù)下游應(yīng)用
• 長期儲存期間沒有DNA降解的風(fēng)險

       REPLI-g Mini Kit使用創(chuàng)新的多位移擴增（MDA）技術(shù),，從小樣品中提供優(yōu)化的全基因組擴增試劑（WGA）,。50μl反應(yīng)的典型DNA產(chǎn)量高達(dá)10μg，平均產(chǎn)物長度大于10kb（范圍在2kb和100kb之間）,。*的REPLI-g技術(shù)可從各種小型或珍貴樣品中提供高度均一的WGA,，包括純化的基因組DNA，或直接來自新鮮或干燥的血液,，口腔拭子,，新鮮或冷凍組織和細(xì)胞。這種簡單可靠的方法能夠?qū)蚪M進行準(zhǔn)確和無偏的擴增,，并生成DNA,，無需進一步純化或定量即可應(yīng)用于不需要標(biāo)記的下游應(yīng)用。與基于PCR的WGA技術(shù)相比,，

性能

來自各種樣品的高產(chǎn)量,，適用于多種應(yīng)用

      使用REPLI-g Mini Kit，可以使用各種臨床和非臨床研究樣本,，包括基因組DNA,，新鮮或干燥的血液，新鮮或冷凍組織和細(xì)胞,。每50μl反應(yīng)的典型DNA產(chǎn)量始終達(dá)到10μg,，而無論模板DNA的數(shù)量如何，通常都能獲得均一的擴增DNA產(chǎn)量,。從不同的模板濃度獲得均勻的DNA產(chǎn)量始終是重要的,，但對于高通量應(yīng)用尤其重要，這需要隨后的遺傳分析,，而無需額外測量或調(diào)整DNA濃度,。

      REPLI-g擴增DNA的平均產(chǎn)物長度通常大于10kb，范圍在2kb和100kb之間,，使得能夠進行下游應(yīng)用,，例如復(fù)雜的限制酶分析和長程PCR。REPLI-g擴增的DNA非常適用于基因分型應(yīng)用,，例如使用TaqMan®引物/探針組進行SNP基因分型,，測序和STR /微衛(wèi)星分析。

成功用于下一代測序

      許多出版物已經(jīng)證明REPLI-g擴增DNA成功應(yīng)用于下一代測序（NGS）應(yīng)用,，包括從腫瘤細(xì)胞的外顯子組和全基因組測序,，到宏基因組學(xué)研究，到單細(xì)胞分析（對于一系列近期出版物而言）在NGS中成功使用REPLI-g，請參閱我們的WGA資源頁面）,。由于使用全基因組擴增的DNA用于NGS和陣列應(yīng)用已經(jīng)引起爭議,，我們檢測到可能影響使用擴增DNA用于這些下游應(yīng)用的成功的潛在因素。我們確定輸入材料的質(zhì)量強烈影響下游NGS實驗的成功,。如果使用低質(zhì)量DNA（例如,，降解的DNA）或老化的組織材料，所得到的擴增的DNA可能不會給出可靠的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）,。然而,，使用REPLI-g技術(shù)的WGA在完整細(xì)胞或未降解的純化DNA上顯示NGS結(jié)果與用純化的gDNA獲得的結(jié)果相當(dāng)?；蚪M基因座序列的序列覆蓋和比對比較表明WGA后的垃圾DNA水平小化,，而擴增和基因組DNA的錯誤率在相似的百分比范圍內(nèi)。

高保真全基因組擴增

      REPLI-g技術(shù)在整個基因組中提供高度均一的DNA擴增,。Phi29聚合酶可復(fù)制高達(dá)70kb而不與基因組DNA模板解離,。與基于PCR的全基因組擴增（WGA）技術(shù)相比，Phi29聚合酶具有3'→5'核酸外切酶校正活性,，并且在復(fù)制期間與Taq DNA聚合酶相比保持高達(dá)1000倍的保真度,。試劑盒中提供的外切核酸酶抗性引物可確保高產(chǎn)量的DNA產(chǎn)物，WGA緩沖系統(tǒng)針對非常長的閱讀長度和無偏的基因座表現(xiàn)進行了優(yōu)化,。

REPLI-g優(yōu)于基于PCR的WGA方法

      傳統(tǒng)的基因組DNA擴增方法包括創(chuàng)建EBV轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的耗時過程,，然后使用隨機或簡并寡核苷酸引發(fā)的PCR進行全基因組擴增。此外,，如其他供應(yīng)商通常使用的基于PCR的方法（例如,，DOP-PCR和PEP）可以產(chǎn)生非特異性擴增假象并且給出基因座的不*覆蓋。在一些情況下,，可能產(chǎn)生小于1kb長的DNA,，其不能用于許多下游應(yīng)用中。通常,，由于使用低保真酶Taq,，產(chǎn)生的DNA具有高得多的突變率DNA聚合酶，可導(dǎo)致容易出錯的擴增,，導(dǎo)致例如單堿基對突變,，STR收縮和擴增。與這些缺點相反,，REPLI-g在整個基因組中提供高度均一的擴增,，在擴增過程中具有小的基因座偏差和小的突變率（參見“ 使用REPLI-g技術(shù)的高度代表性擴增 ”和“ *且準(zhǔn)確的全基因組擴增 ”） ）。

原理

      *的REPLI-g技術(shù)使用創(chuàng)新的高保真酶Phi 29聚合酶,，使用多重置換擴增（MDA）和溫和的堿性變性步驟擴增復(fù)雜的基因組DNA，以均勻地擴增基因組位點。REPLI-g Mini Kit的典型產(chǎn)量高達(dá)10μg,，可以根據(jù)您的需要使用REPLI-g Midi Kit輕松按比例縮小,，因為兩種試劑盒都基于相同的方案并使用相同的反應(yīng)體積。簡單的反應(yīng)設(shè)置和約15分鐘的極低處理時間使得REPLI-g成為一種簡單可靠的方法,，當(dāng)需要有限或珍貴樣品的完整和無偏的軌跡表示時,。

放大原理

      REPLI-g使用等溫基因組擴增，稱為多位移擴增（MDA）,，其涉及隨機六聚體與變性DNA的結(jié)合,，然后使用酶Phi29聚合酶在恒定溫度下進行鏈置換合成。在用作模板的每個置換鏈上發(fā)生另外的引發(fā)事件,，使得能夠產(chǎn)生高產(chǎn)量的擴增DNA,。Phi 29聚合酶是一種噬菌體衍生酶，是一種具有3'→5'主要核酸外切酶活性（校對活性）的DNA聚合酶,，與Taq相比,，其保真度高達(dá)1000倍。DNA聚合酶,。在*,，優(yōu)化的REPLI-g緩沖系統(tǒng)的支持下，Phi 29聚合酶可輕松解決二級結(jié)構(gòu),，如發(fā)夾環(huán)，從而防止聚合酶在擴增過程中滑脫,，停止和解離,。這使得能夠產(chǎn)生高達(dá)100kb的DNA片段而沒有序列偏。

DNA的堿性變性

      基因組DNA在用于酶擴增程序之前必須變性,，這通常使用苛刻的方法完成,，例如在升高的溫度下孵育（加熱孵育）或增加的pH（化學(xué)堿性孵育）。REPLI-g Midi Kit使用溫和的堿性孵育,，允許均勻的DNA變性,，DNA碎片非常低或產(chǎn)生無堿基位點,。這導(dǎo)致擴增的DNA具有非常高的完整性，并使擴增片段的長度大化,，從而均勻地表示基因組基因座和序列,。使用REPLI-g Mini Kit,，可確保在后續(xù)下游應(yīng)用中獲得可靠的結(jié)果，而不會出現(xiàn)假陽性或陰性數(shù)據(jù),，這與其他使用熱誘導(dǎo)變性的WGA技術(shù)不同,，后者會損害模板DNA，從而導(dǎo)致偏向和代表性不足的位點

程序

簡單,，一管程序

      REPLI-g Mini Kit使用簡單可靠的方法從少量分離的靶基因組DNA或直接從全血,，干血卡,，血沉棕黃層和組織培養(yǎng)細(xì)胞中獲得準(zhǔn)確的基因組擴增,。加入裂解緩沖液，裂解樣品材料并使DNA變性,，然后進行短時間的孵育。中和后,，加入預(yù)混合物（包括REPLI-g Mini DNA聚合酶），等溫擴增反應(yīng)在30℃下進行過夜,。REPLI-g擴增的DNA可以在-20°C下長期保存,，沒有負(fù)面影響,。

應(yīng)用

REPLI-g擴增基因組可用于多種下游應(yīng)用，包括：

• 使用TaqMan®引物/探針組進行SNP基因分型
• 基于qPCR和PCR的突變檢測
• 新一代測序
• STR /微衛(wèi)星分析
• 桑格測序
• RFLP和Southern印跡分析
• 陣列技術(shù)，如比較基因組雜交 

QIAGEN REPLI-g Mini Kit 全基因組擴增試劑

QIAGEN REPLI-g Mini Kit產(chǎn)品訂購信息

 品牌                         產(chǎn)品貨號                 產(chǎn)品名稱                

QIAGEN                    150023              REPLI-g Mini Kit （25）          

QIAGEN                    150025              REPLI-g Mini Kit （100）

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