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人抗肌聯(lián)蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒說明書
閱讀：2785發(fā)布時間：2016-6-27
人抗肌聯(lián)蛋白抗體(TTN)ELISA試劑盒說明書
本試劑盒應用競爭抑制酶標免疫分析法測定標本中待測物質(zhì)水平,。用純化的抗原包被微孔板,，往包被抗體的微孔中同時加入酶標的抗體和待測抗體，被測抗體與酶標記抗體對特異性抗原進行競爭結合,。經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。待測標本濃度越高,，標記抗體和抗原的結合就越受到抑制，顯色愈淺,。顯色的深淺與酶量呈正相關,，而與樣品中待測物質(zhì)含量呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),，計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊(96孔)
2. 標準品(凍干品)：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100pmol/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋100 pmol/ml， 50 pmol/ml，25 pmol/ml,，12.5pmol/ml,， 6.25 pmol/ml，3.12 pmol/ml,，1.56 pmol/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0pmol/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制50 pmol/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100pmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4),。
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 xg離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 xg離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
3. 其它生物標本：請1000 xg離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
注：以上標本置4℃保存應小于1周,，-20℃或-80℃均應密封保存,，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月,；標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,；高血脂的標本不需進行特殊處理,，可直接檢測。
操作步驟
實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，均應用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立*稀釋倍數(shù),。
1. 加樣：分別設空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘,。
為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內(nèi)配制),，37℃,60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul，37℃,，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止),。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應,，此時藍色立轉黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測,。
注：
1. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
2. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑,。
3. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。
4. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。
5. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
6. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10ul)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A,、B，以及底物溶液在使用前,，應置于37℃溫育30分鐘,；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
7. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需
要，重復此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人抗titin抗體,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD值為縱坐標(普通坐標),，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curveexpert1.3)，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。
3. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。
4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
5. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆,。
6. 底物請避光保存。
檢測范圍：1.56 pmol/ml - 100 pmol/ml
zui低檢測限：0.78 pmol/ml
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果,。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 /標準品，酶結合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的“預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。
7. 所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8. 有效期：6個月
本試劑盒應用競爭抑制酶標免疫分析法測定標本中待測物質(zhì)水平,。用純化的抗原包被微孔板,，往包被抗體的微孔中同時加入酶標的抗體和待測抗體，被測抗體與酶標記抗體對特異性抗原進行競爭結合,。經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色,。TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成zui終的黃色,。待測標本濃度越高,，標記抗體和抗原的結合就越受到抑制，顯色愈淺,。顯色的深淺與酶量呈正相關,，而與樣品中待測物質(zhì)含量呈負相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),，計算樣品濃度,。
試劑盒組成及試劑配制
1. 酶聯(lián)板：一塊(96孔)
2. 標準品(凍干品)：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml,，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100pmol/ml,，做系列倍比稀釋后,，分別稀釋100 pmol/ml， 50 pmol/ml，25 pmol/ml,，12.5pmol/ml,， 6.25 pmol/ml，3.12 pmol/ml,，1.56 pmol/ml,，樣品稀釋液直接作為標準濃度0pmol/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。
如配制50 pmol/ml標準品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 100pmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3. 樣品稀釋液：1×20ml/瓶,。
4. 檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。
5. 檢測稀釋液B：1×10ml/瓶,。
6. 檢測溶液A：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液A1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預先計算好的每次實驗所需的總量配制(100ul/孔)，實際配制時應多配制0.1-0.2ml,。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制,。
7. 檢測溶液B：1×120ul/瓶(1:100)臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶,，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10. 終止液：1×10ml/瓶(2N H2SO4),。
標本的采集及保存
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 xg離心20分鐘,，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 xg離心15分鐘,，或將標本放于-20℃或-80℃保存,，但應避免反復凍融。
3. 其它生物標本：請1000 xg離心20分鐘,，取上清即可檢測,，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融,。
注：以上標本置4℃保存應小于1周,，-20℃或-80℃均應密封保存,，-20℃不應超過3個月，-80℃不應超過6個月,；標本溶血會影響zui后檢測結果,，因此溶血標本不宜進行此項檢測,；高血脂的標本不需進行特殊處理,，可直接檢測。
操作步驟
實驗開始前,，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭?；試劑或樣品稀釋時，均需混勻,，混勻時盡量避免起泡,。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時,，均應用樣品稀釋液進行稀釋,，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預實驗以建立*稀釋倍數(shù),。
1. 加樣：分別設空白孔,、標準孔、待測樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘,。
為保證實驗結果有效性,，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul(在使用前一小時內(nèi)配制),，37℃,60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔,，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干),。
4. 每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100ul，37℃,，60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體,，甩干,，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘,，350ul/每孔,，甩干(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)。
6. 依序每孔加底物溶液90ul,，37℃避光顯色(30分鐘內(nèi),，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯,，即可終止),。
7. 依序每孔加終止溶液50ul，終止反應,，此時藍色立轉黃色,。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,，底物反應時間到后應盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測,。
注：
1. 每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔(不同于空白孔),，該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4,。測量時先用此孔調(diào)OD值至零,。
2. 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫,。使用后立即冷藏保存試劑,。
3. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。為防止樣品蒸發(fā),，試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應盡快進行下步操作,，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。
4. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。
5. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
6. 未使用完的酶標板或者試劑,，請于2-8℃保存,。標準品、檢測溶液A工作液,、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用,，請配置標準品及工作液,，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時,，一次不要小于10ul)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差,；檢測液A,、B，以及底物溶液在使用前,，應置于37℃溫育30分鐘,；請勿重復使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液,。
7. 建議檢測樣品時均設雙孔測定,，以保證檢測結果的準確性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內(nèi)的液體,；在實驗臺上鋪墊幾層吸水
紙,，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi),，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需
要，重復此過程數(shù)次,。
自動洗板：如果有自動洗板機,，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人抗titin抗體,，且與其它相關蛋白無交叉反應,。
計算
以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標)，OD值為縱坐標(普通坐標),，在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線(推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析,，如curveexpert1.3)，根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實際濃度。
注意事項
1. 洗滌過程非常重要,，不充分的洗滌易造成假陽性,。
2. 一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多,，推薦使用多道移液器加樣,。
3. 請每次測定的同時做標準曲線，做復孔,。
4. 如標本中待測物質(zhì)含量過高,，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù),。
5. 在配制標準品,、檢測溶液工作液時，請以相應的稀釋液配制,，不能混淆,。
6. 底物請避光保存。
檢測范圍：1.56 pmol/ml - 100 pmol/ml
zui低檢測限：0.78 pmol/ml
說明
1. 在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中,。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和污染,，試劑避免受到微生物的污染，因為蛋白水解酶的干擾將導致出現(xiàn)錯誤的結果,。
2. 小心吸取試劑并嚴格遵守給定的孵育時間和溫度,。請注意在吸取標本 /標準品，酶結合物或底物時,，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大,，將會導致不同的“預孵育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性,。而且,，洗滌不充分將影響試驗結果。
3. 試劑盒保存：部分試劑保存于-20℃,，部分試劑保存于2-8℃,，具體以標簽上的標示為準。
4. 濃洗滌液會有鹽析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,。
5. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會含有少許水樣物質(zhì)，此為正?，F(xiàn)象,，不會對實驗結果造成任何影響,。
6. 中、英文說明書可能會有不一致之處,，請以英文說明書為準,。
7. 所有的樣品都應管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置,。
8. 有效期：6個月
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