檢測原理:試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA),。往預(yù)先包被維生素D(VD)抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本,、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的維生素D(VD)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度,。

樣品收集,、處理及保存方法:

1.血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。

4.組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍,。

自備物品

1.37℃恒溫箱

2.酶標(biāo)儀(450nm)

3.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

操作注意事項

1.試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。

2.實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封(低溫干燥)保存,。

3.濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5倍，zui終結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度,。

4.嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時間,、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.所有液體組分使用前充分搖勻,。

人維生素D(VD)ELISA檢測試劑盒組成:

名稱96孔配置48孔配置備注

微孔酶標(biāo)板12 孔×8 條12 孔×4 條無

標(biāo)準(zhǔn)品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無

樣本稀釋液6mL 3mL 無

檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無

20×洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明書進(jìn)行稀釋

底物A 6mL 3mL 無

底物B 6mL 3mL 無

終止液6mL 3mL 無

封板膜2 張2 張無

說明書1 份1 份無

自封袋1 個1 個無

注：標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為：0,、3、6,、12,、24、48 ng/mL

試劑的準(zhǔn)備:20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1:20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。

洗板方法

1.自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。

2.手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干，如此洗板5次,。

操作步驟:

1.從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,；

3.樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；空白孔不加,。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔,，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體,，吸水紙上拍干,，每孔加滿洗滌液，靜置1min,，甩去洗滌液,，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板),。

6.每孔加入底物A,、B各50μL,，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL,，15min 內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷:繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中,，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線,，按曲線方程計算各樣本濃度值,。

試劑盒性能:

1.準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900,。

2.靈敏度：zui低檢測濃度小于1.0 ng/mL,。

3.特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%,。

5.貯藏：2-8℃，避光防潮保存,。

6.有效期：6個月

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