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TRIzol法提取總RNA的實(shí)驗(yàn)原理
閱讀：3340發(fā)布時(shí)間：2022-3-23
說(shuō)完磁珠法,，今天帶大家看一下同樣常用的TRIzol法核酸提取，適用于人類,、動(dòng)物,、植物,、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克,，常用于從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA,，拒絕蛋白和DNA污染。
實(shí)驗(yàn)原理：
RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù),，RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗,。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),，能迅速破碎細(xì)胞,，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。TRIzol使樣品勻漿化,，細(xì)胞裂解,，溶解細(xì)胞內(nèi)含物，同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性,。在加入氯仿離心后,，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中,。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA,；用乙醇沉淀中間層可回收DNA；用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì),。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1,、將組織在液氮中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨,，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%,。
2、研磨液室溫放置5分鐘,，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒,。
3,、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,，室溫放置10分鐘,，12000g離心10分鐘。
4,、棄去上清液,，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻,，4℃下7500g離心5分鐘,。
5,、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘,，注意不要干燥過(guò)分,，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,，必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘,。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃,。
[注意] 1,、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作,。
2,、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,，-20℃保存一年,。
3.由于樣本性質(zhì)和數(shù)量的區(qū)別，在樣本取樣后處理方式均有不同,，紅榮微再有專業(yè)的技術(shù)崗位為您保駕護(hù)航,，為您解決試劑使用過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題，保證實(shí)驗(yàn)成果,。
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品牌 貨號(hào) 名稱 規(guī)格
thermo Invitrogen 15596026 TRIzol™ 試劑 100mL
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