實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介：
細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)創(chuàng)建于1907年,，歷經(jīng)一個(gè)世紀(jì)磨練與升華，現(xiàn)已成為自然科學(xué)領(lǐng)域*的研究方法之一,。小伙伴們要想在如今細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)廣泛滲透的科學(xué)研究領(lǐng)域搞好科研,，最基礎(chǔ)的細(xì)胞株的冷凍保存和解凍復(fù)蘇技術(shù)自然不能忽視。
細(xì)胞凍存是將細(xì)胞放在低溫環(huán)境,，減少細(xì)胞代謝,，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存的一種技術(shù)。細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,，起到了細(xì)胞保種的作用,。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.材料準(zhǔn)備：

生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞、新鮮培養(yǎng)基,、DMSO,、無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、等速降溫機(jī)

2.冷凍方法理論準(zhǔn)備:

(1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘--->-20℃30分鐘--->-8O℃16~18小時(shí)(或隔夜)--->液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。-20℃不可超過(guò)1小時(shí),，以防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-8O℃冰箱中,。
(2）程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機(jī)以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至（-8o℃以下) -120℃，再放在液氮槽長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma之保存,。

實(shí)驗(yàn)步驟：

細(xì)胞凍存步驟：

1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍;
2.加入適量胰酶,，置于培養(yǎng)箱中消化;
3.待消化到位后加入適量血清或*培養(yǎng)基終止消化,，800-1000rpm離心3-5min;
4.配制凍存液，待細(xì)胞離心后去上清,，加入凍存液重懸,，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106~1×107 cells/mL,，轉(zhuǎn)移到凍存管中;
5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過(guò)夜,，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存,。
6.凍存細(xì)胞后應(yīng)取出一管復(fù)蘇，檢測(cè)細(xì)胞的存活率,。理論上細(xì)胞可在液氮內(nèi)長(zhǎng)期保存,，
為穩(wěn)妥起見(jiàn)可在細(xì)胞凍存半年后復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,，再繼續(xù)凍存

注意事項(xiàng)
1.欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高之狀態(tài),，約為80~90%致密度。
冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其*性質(zhì),，例如hybridoma應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生,。

2.細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存無(wú)*，而不會(huì)影響細(xì)胞活力﹔在-70度可保存數(shù)月,。注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì),。
DMSO應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，無(wú)菌且無(wú)色是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品,，以5~10m1小體積分裝,，4℃避光保存，勿作多次解凍,。

3.凍存細(xì)胞數(shù)量要足夠,。無(wú)論再怎么小心，細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇過(guò)程中總會(huì)死掉一批的,。所以,，一開(kāi)始凍存細(xì)胞的數(shù)量要足夠。一般要達(dá)到5× 10^6 /毫升,，一瓶不夠兩瓶湊,。但是，這個(gè)不能一概而論,。有些細(xì)胞,，比如雜交瘤細(xì)胞，只需要1-3x 10^6 /毫升

細(xì)胞復(fù)蘇

1.操作人員應(yīng)戴防護(hù)面罩及手套,，防止冷凍管可能爆裂之傷害,。
2.自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊,，由于熱脹冷縮過(guò)程,，此時(shí)蓋子易松掉。
3.將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,，回溫后噴以70酒精并擦拭之,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
4.取出冷凍管,，立即放入3℃水槽中快速解凍,，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以7O%酒精擦拭保存管外部,，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi),。
5.取出解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),，混合均勻,，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1m1解凍細(xì)胞懸浮液作存活測(cè)試,。
6.解凍后是否立即去除冷凍保護(hù)劑,，依細(xì)胞種類而異，一般而言,，大都不需要立即去除冷凍保護(hù)劑,。
惟若要立即去除，則將解凍之細(xì)胞懸浮液加入含有5-10m1培養(yǎng)基之離心管內(nèi),，離心 1000rpm,，5分鐘，移去上清液,，加入新鮮培養(yǎng)基,，混合均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),。

注意事項(xiàng)
1.復(fù)蘇速度越快越好,。從液氮罐里取出來(lái)之后，迅速放在37°C水浴中,，搖晃令其盡快融化,。

2.解凍后的細(xì)胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清。因?yàn)槊恳环N細(xì)胞都有自己特定的,，并且已經(jīng)熟悉了的生長(zhǎng)環(huán)境,。突然使用不一樣的培養(yǎng)液和血清，會(huì)造成細(xì)胞生長(zhǎng)不良,，甚至死亡,。

關(guān)于產(chǎn)品
CryoStor®是Biolife公司特別優(yōu)化的細(xì)胞凍存液，在極低溫度 (-70ºC to -196ºC)下準(zhǔn)備和保存細(xì)胞,。預(yù)混DMSO,，為細(xì)胞和組織的冷凍、儲(chǔ)存和解凍過(guò)程提供安全的保護(hù)環(huán)境,。CryoStor®通過(guò)調(diào)控凍存過(guò)程的分子生物學(xué)反應(yīng),，無(wú)血清,、蛋白或具有高細(xì)胞毒性的試劑，就能增強(qiáng)細(xì)胞活力和功能,。

貨號(hào) 產(chǎn)品描述規(guī)格
210210 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 1000mL/袋
210202 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 100mL/袋
210102 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 100mL/瓶
210374 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 16mL/瓶
210373 CryoStor Cs10 Freeze Media細(xì)胞凍存液 10mL/瓶
現(xiàn)貨供應(yīng)中,，欲購(gòu)從速。

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